两个水稻泛素化相关锌指蛋白及锌转运体蛋白OZT1的功能研究

摘要

干旱、高盐、低温、高温及重金属离子等非生物胁迫是影响植物生长发育及产量的重要限制因子。植物A20/AN1锌指蛋白及金属转运体蛋白在植物非生物胁迫响应中具有重要功能。本研究分析了两个水稻A20/AN1型锌指蛋白ZFP177、ZFP181及锌转运体蛋白OZT1的分子特性及它们在非生物逆境胁迫中的功能和可能的作用机制。主要研究结果如下:
　　1.ZFP177在水稻成株期的各个组织中均有表达，高温(42℃)、低温(4℃)及氧化胁迫（100mMH2O2）等非生物胁迫均能诱导其表达。亚细胞定位结果表明ZFP177分布于整个细胞，包括细胞质、质膜与细胞核。对获得的ZFP177过量表达转基因植株进行PCR、RT-PCR、Southernblot及Westernblot检测。ZFP177过表达转基因植株降低了耐盐性及耐旱性。在酵母体内，ZFP177不具有转录激活功能。利用酵母双杂交筛选冷诱导eDNA文库及穗eDNA文库，获得了5个与ZFP177互作的蛋白:AIP1-5。BLAST同源比对及蛋白结构域分析表明:AIP1为多聚泛素;AIP2为泛素单体;AIP3为泛素延伸蛋白;AIP4为NAC转录因子;AIP5为RAD23家族蛋白。酵母体内及Pulldown体外互作分析结果表明ZFP177确实能与以上5种蛋白互作，并且互作依赖于ZFP177的A20结构域。体外E3活性检测结果说明ZFP177具有E3泛素连接酶活性，在E1，E2及泛素(ubiqutin)存在下能在体外自身泛素化，共价结合1-2个泛素单体。ZFP177过表达转基因水稻幼苗iTRAQ定量分析结果表明，ZFP177过量表达导致26种蛋白显著上调，151种蛋白显著下调，主要导致泛素-蛋白酶体途径、氨基酸衍生物及吲哚衍生物生物合成途径相关蛋白水平降低。推测ZFP177可作为E3泛素连接酶通过泛素-蛋白酶体途径参与植物的非生物胁迫响应。
　　2.ZFP181在水稻成株期的各个组织中均有表达。ABA以及各种非生物胁迫下ZFP181的表达分析结果表明其受低温(4℃)、渗透胁迫(20％PEG)、盐胁迫(100mMNaCl)及氧化胁迫（100mMH2O2）诱导，受高温胁迫(42℃)抑制，而在ABA(50μM)处理条件下ZFP181的表达未发生显著变化。亚细胞定位结果表明ZFP181主要分布于细胞核中。通过转基因技术获得ZFP181启动子，ZFP181过量及RNAi转基因植株，并对过量表达及抑制表达ZFP181的转基因水稻植株进行PCR，RT-PCR和Southernblot检测。ZFP181启动子转基因植株的GUS活性分析结果表明ZFP181在水稻的各个组织中均能表达。ZFP181能增强转基因水稻耐盐及耐旱性，降低植株对外源ABA的敏感性。ZFP181过表达导致GA生物合成途径相关基因表达下降，内源GA3水平降低以及转基因植株矮化;外源GA3处理能部分恢复ZFP181过表达造成的转基因植株矮化表型。在酵母体内，ZFP181不具有转录激活功能。利用酵母双杂交筛选冷诱导eDNA文库及穗cDNA文库，获得了1个与ZFP181互作的蛋白:EEPD1(endonuclease/exonuclease/phosphatasefamilydomaincontainingprotein)。BLAST同源比对及蛋白结构域分析表明:EEPD1包含Exo_endo_phos保守结构域。通过酵母体内互作分析结果表明ZFP181确实能与EEPD1蛋白互作，并且缺失A20或AN1结构域都能导致互作的尚失。体外E3活性检测结果说明ZFP181具有E3泛素连接酶活性，在E1，E2及泛素存在下能在体外自身泛素化，共价结合一个泛素分子。推测ZFP181可作为E3泛素连接酶通过泛素-蛋白酶体及GA信号转导途径参与植物的生长发育及非生物胁迫响应。
　　3.酵母体内定位分析结果表明OZT1定位于液泡中，异源表达OZT1能提高酵母细胞对Zn2+和Cd2+胁迫的耐受性，但不能提高其对Mn2+胁迫的耐受性。推测OZT1是液泡定位的锌转运体，可通过将金属离子Zn2+，Cd2+等转运到液泡内提高生物体对Zn2+，Cd2+等重金属离子的耐受性。

目录

声明

摘要

第一章 A20／AN1锌指蛋白研究进展

1 A20／AN1锌指蛋白的发现与结构特征

2 A20／AN1锌指蛋白的功能

2．1 参与生长发育及免疫反应过程

2．2 参与非生物胁迫响应

3 植物A20／AN1锌指蛋白参与非生物胁迫响应的研究

4 植物A20／AN1锌指蛋白参与生长发育及非生物胁迫响应的机制研究

4．1 通过蛋白互作参与生长发育及非生物胁迫响应

4．2 通过GA信号途径参与生长发育及非生物胁迫响应

4．3 通过泛素结合及E3活性参与生长发育及非生物胁迫响应

5 植物A20／AN1锌指蛋白基因家族研究展望

第二章 泛素-26S蛋白酶体途径及其在植物非生物胁迫中的功能研究

1 泛素-26S蛋白酶体途径

1．1 泛素分子特性研究

1．2 泛素连接级联反应

1．3 26S蛋白酶体基本结构及功能的研究

1．4 泛素-26S蛋白酶体途径

2 植物非生物胁迫响应及其调控

2．1 植物非生物胁迫响应的途径

2．2 植物非生物胁迫信号的调控

3 UPS在植物非生物胁迫中的功能

3．1 UPS是非生物胁迫响应所必需的

3．2 UPS参与激素信号途径

3．3 UPS参与水分胁迫信号转导

3．4 UPS参与冷胁迫信号转导

3．5 UPS与UV胁迫响应

第三章 水稻A20／AN1型锌指蛋白ZFP177参与泛素-26S蛋白酶体途径及非生物胁迫响应

1 材料与方法

1．1 植物材料及处理

1．2 总RNA的提取和cDNA第一链的合成

1．3 Quantitative Real-time PCR分析

1．4 亚细胞定位分析

1．5 水稻转基因植株的获得及鉴定

1．6 转基因水稻的耐逆性分析

1．7 酵母双杂交筛选互作蛋白

1．8 ZFP177及其相关突变蛋白的原核表达分析

1．9 AIP1及AIP2蛋白的原核表达分析

1．10 GST Pull Down体外分析蛋白互作

1．11 His Pull down分析蛋白的体外互作

1．12 Western blot验证pull down捕获的互作蛋白

1．13 E3泛素连接酶活性分析

1．14 ZFP177过量表达转基因水稻幼苗蛋白质iTRAQ定量分析

2 结果和分析

2．1 ZP177在水稻不同组织及处理下的表达分析

2．2 ZFP177的亚细胞定位分析

2．3 ZP177转基因材料的获得及验证

2．4 ZFP177过量表达水稻植株的农艺性状考察

2．5 ZFP177过量表达转基因水稻植株的耐逆性分析

2．6 酵母双杂交筛选ZFP177互作蛋白

2．7 ZFP177与泛素互作特性分析

2．8 ZFP177与AIP4，AIP5互作特性分析

2．9 ZFP177蛋白E3活性分析

2．10 ZFP177过表达转基因水稻幼苗蛋白质iTRAQ定量分析

3 讨论

3．1 ZFP177及其家族蛋白与泛素互作特性

3．2 ZFP177及其家族蛋白与泛素-26S蛋白酶体系统的关系

3．3 ZFP177参与非生物胁迫反应及生长发育

3．4 ZFP177参与非生物胁迫及生长发育调控的机制

第四章 水稻A20／AN1型锌指蛋白ZFP181参与生长发育及非生物胁迫响应

1 材料和方法

1．1 植物材料及处理

1．2 总RNA的提取和cDNA第一链的合成

1．3 Quantitative Real-time PCR分析

1．4 亚细胞定位分析

1．5 水稻转基因植株的获得及鉴定

1．6 转基因水稻对外源ABA的敏感性及耐逆性分析

1．7 转基因水稻内源激素(GA，ABA，IAA)含量测定

1．8 ZFP181对GA3及PAC的响应特性分析

1．9 酵母双杂交筛选互作蛋白

1．10 ZFP181的原核表达分析

1．11 ZFP181的E3泛素连接酶活性分析

1．12 ZFP181转基因水稻的转录组分析

2 结果和分析

2．1 ZFP181在水稻不同组织及处理下的表达分析

2．2 ZFP181的亚细胞定位分析

2．3 ZFP181相关转基因水稻植株的获得及验证

2．4 ZFP181启动子转基因水稻的GUS活性分析

2．5 ZFP181过量及干涉抑制表达转基因水稻植株的农艺性状考察

2．6 ZFP181过量及干涉抑制转基因水稻耐逆性分析

2．7 ZFP181过量及干涉抑制转基因水稻对外源ABA的敏感性分析

2．8 ZFP181对GA3及PAC的响应特性分析

2．9 转基因水稻内源GA，IAA及ABA含量的测定

2．10 ZFP181对表达转基因水稻的转录组分析

2．11 ZFP181的E3泛素连接酶活性检测

2．12 酵母双杂交筛选ZFP181互作蛋白

3 讨论

3．1 ZFP181参与非生物胁迫反应及生长发育

3．2 ZFP181参与非生物胁迫及生长发育调控的机制

第五章 水稻锌转运体OZT1的功能分析

1 材料和方法

1．1 菌株与载体

1．2 亚细胞定位载体构建及其在酵母细胞中的定位分析

1．3 酵母表达载体构建及其在酵母细胞中的表达

1．4 酵母感受态细胞的制备及醋酸锂法转化

1．5 酵母细胞的金属离子胁迫分析

2 结果和分析

2．1 OZT1亚细胞定位载体构建及其在酵母细胞中的定位分析

2．2 OZT1酵母表达载体构建及其在酵母细胞中的表达

2．3 酵母体内分析OZT1对金属离子胁迫的响应

3 讨论

全文结论

全文创新点

附录

参考文献

攻读博士期间发表的论文

致谢