马铃薯花色苷生物合成调控基因StAN11和StAN1b分离与分析

摘要

马铃薯块茎的颜色是由花色苷的种类与含量所决定的。在彩色马铃薯块茎中，含有丰富的花色苷，具有良好的抗氧化特性。在高等植物中，花色苷的生物合成代谢途径受到三类转录因子调控，即MYB转录因子，bHLH转录因子扣WD40类转录因子。目前已经在拟南芥，玉米等模式作物中分离鉴定了许多与花色苷调控相关的转录因子。马铃薯中分离得到的WD40类转录因子基因StAN11是矮牵牛AN11和拟南芥TTG1的同源基因，在块茎发育过程中，StAN11的表达水平和花色苷的积累呈正相关，而bHLH转录因子未见报道。本研究首先从马铃薯中分离得到StAN11和StAN1b基因序列，然后采用农杆菌介导的遗传转化方法，将马铃薯StAN11导入到马铃薯栽培品种Désirée，并研究转基因植株中的花色苷积累和相关基因的表达模式。研究结果如下:
　　(1)采周RT-PCR方法从马铃薯品种Chieftain中扩增得到StAN11cDNA，将开放阅读框序列置于组成型启动子CAMV35S之后，通过农杆菌介导方法获得了6个35S:StAN11转基因株系。在生长50天左右转基因植株中，块茎的StAN11表达水平显著提高，结构基因DFR同时也诱导上调，块茎中花色苷含量显著增加，其他结构基因F3H,ANS,3GT表达水平无明显变化。
　　(2)从马铃薯栽培品种Désirée块茎中分离克隆得到花色苷调控bHLH类转录因子基因StAN1b，该基因具有7个内含子，8个外显子，编码一个631个氨基酸残基组成的蛋白，理论等电点为5.00，蛋白的分子量为69.39kDa。StAN1b与茄科植物番茄的同源蛋白序列一致性最高,亲缘关系也最近。组织表达分析显示，StAN1b在叶，芽，薯皮中表达较高，在匍匐茎中有较低的表达，而在根，茎，薯肉中不表达。

目录

声明

摘要

缩略词及其英汉对照

前言

第一章 文献综述

1 花色苷概述

1．1 花色苷的种类及结构

1．2 花色苷的生理功能

1．3 花色苷的生物合成途径

1．4 花色苷生物合成中的关键结构基因

1．5 花色苷生物合成中的调节基因

1．6 转录激活调控

1．7 转录抑制调控

1．8 转录后水平的调控

1．9 影响花色苷合成的因素

1．10 植物花色苷基因工程

2 马铃薯与花色苷

2．1 马铃薯花色苷的分布和种类

2．2 影响马铃薯块茎颜色的因素

2．3 马铃薯花色苷合成相关的基因

2．4 马铃薯植物遗传转化

第二章 花色苷转录因子StAN11表达载体的构建

1 材料

1．1 植物材料

1．2 载体与菌种

1．3 培养基

1．4 分子生物学试剂

2 方法

2．1 总RNA的提取

2．2 cDNA第一链的合成

2．3 StAN11 cDNA PCR扩增

2．4 StAN1过表达载体的构建

2．5 农杆菌的转化

3 结果与分析

3．1 StAN11开放阅读框的PCR扩增结果

3．2 pCAMBIA1304-StAN11表达载体的构建

3．3 重组载体农杆菌的转化

第三章 马铃薯StAN11基因的遗传转化

1 材料

1．1 植物材料

1．2 菌株与质粒

1．3 培养基

1．4 酶及各种生化试剂

2 方法

2．1 马铃薯遗传转化

2．2 转基因植株的PCR验证

2．3 转基因植株中的StAN11半定量分析

3 结果

3．1 转基因马铃薯植株再生

3．2 转基因植株的PCR鉴定

3．3 转基因株系中StAN11表达分析

4 讨论

第四章 转基因马铃薯中花色苷合成基因的表达分析

1 材料

1．1 供试材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 转基因马铃薯植株的表型

2．2 转基因植株块茎中花色苷含量的测定

2．3 转基因马铃薯块茎中淀粉含量的测定

2．4 转基因马铃薯块茎中StAN11表达分析

2．5 转基因马铃薯花色苷合成结构基因表达分析

3 讨论

第五章 马铃薯bHLH转录因子StAN1b的克隆与表达分析

1 材料

1．1 植物材料

1．2 菌株和载体

1．3 酶与化学试剂

2 方法

2．1 StAN1b cDNA的扩增和组织表达分析

2．2 StAN1b组织半定量RT-PCR分析

2．3 生物信息学分析

3 结果

3．1 StAN1b基因的克隆与序列分析

3．2 StAN1b的组织表达分析

4 讨论

4．1 StAN1b的结构特征

4．2 StAN1b的组织表达分析

全文结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的研究论文

致谢