水稻抽穗期基因DTH2的图位克隆与功能分析及其生物学意义

摘要

开花时间（作物中指抽穗期）是决定植物的生长季节和地区适应性以适应特异自然环境的重要农艺性状。水稻（Oryza sativa L.）是起源于热带地区的短日植物。越来越多的证据表明栽培稻向北扩张的现象是与人们在非诱导的长日照(LD)条件下对水稻抽穗期性状的人工选择相伴而生的。本文鉴定了一个在长日照条件下促进抽穗的微效数量性状位点(QTL)DTH2，并对其进行了分子克隆。我们发现DTH2编码一个CO-like蛋白，通过诱导成花素基因Hd3a和RFT1来促进抽穗，并且独立于已知的开花整合子Hd1和Ehd1。通过连锁分析和转基因实验，验证了DTH2中两个功能核苷酸多态性位点，且与亚洲北部自然长日照条件下的提早抽穗和增加生殖适应性相关。此外，发现一个包含这两个功能核苷酸多态性位点的等位基因仅在生长在亚洲北部的粳稻中被固定。群体遗传学和网络分析结果支持DTH2可能是水稻在选择过程中适应长日照的一个靶基因。DTH2中的FNPs极大地扩张了水稻栽培范围，并体现了微效QTLs在作物适应和育种中的重要作用。主要研究结果如下:
　　1.DTH2的图位克隆和功能分析
　　本实验室之前的研究利用一个来源于Asominori（Aso，粳稻）和IR24（籼稻）的重组自交系群体检测到一个微效QTL名为qDTH-2（在此研究中命名为DTH2）。为了研究DTH2在抽穗期中的遗传效应，我们分离了一个以Aso为背景，包含DTH2的9.6-cM IR24插入片段的近等基因系(NIL)。在北京自然长日照(NLD)条件下，与Aso相比，NIL延迟7.4天抽穗，但在海南自然短日照(NSD)条件下差异不显著。另外我们发现在NLD条件下81.5％的Aso种子能成熟，而只有28.6％的NIL种子能成熟。这些结果也证明来自Aso的等位基因能更好地适应NLD条件以形成生殖适应。
　　遗传分析表明DTH2是一个单孟德尔因子，通过1099个晚抽穗的F2∶3家系，我们把DTH2定位到37.6Kb的区间内。在此区间有9个预测的开放阅读框（ORFs），其中ORF5(LOC_Os02g49230)预测编码一个CO-like蛋白。在ORF5的Aso等位基因（DTH2-a）和IR24的等位基因（DTH2-i）的编码序列中检测到4个单核苷酸多态性(SNPs)。通过转基因互补和干扰实验我们证明ORF5就是DTH2。
　　DTH2-a-GFP融合蛋白和一个核标签共定位在水稻叶片原生质体中。转录自激活活性实验表明DTH2在酵母中有很强的转录自激活活性。缺失分析表明存在于锌指结构域和CCT结构域中间的区域对于转录活性是必须的。这些结果表明DTH2在细胞核中的基因表达调控中存在重要作用。
　　为了检测DTH2的时间和空间表达模式，我们用实时定量PCR(qRT-PCR)对来自Aso的各组织中检测DTH2的表达水平。在所有组织中都检测到DTH2的表达，但在叶片和叶鞘中的表达最丰富。和qRT-PCR的结果一致，我们在pDTH2-a∷GUS的转基因植株的叶片、叶鞘、穗、茎和根中也检测到很强的GUS信号。为了研究DTH2表达是否由节律钟调控，Aso和NIL植株在CLD/CSD条件下处理2天，然后转入持续黑暗(DD)/持续光照(LL)条件2天。很明显，经过48小时CLD和CSD的节律处理，当进行DD处理后，DTH2节律表达的振幅急剧降低;而当进行LL处理后，DTH2节律表达的模式不变。说明DTH2的表达由节律钟控制。
　　我们通过比较一些光周期相关基因在Aso和NIL之间的表达差异，发现在CLD条件下，两个成花素基因基因Hd3a和RFT1，在Aso中的表达水平比在NIL中的高，但在CSD条件下几乎一致。随后我们检测DTH2调控Hd3a和RFT1是否由Hd1或Ehd1介导，然而在Aso和NIL之间Hd1或Ehd1的表达没有显著差异。另外，在携带有无功能的hd1或ehd1等位基因的NILs中，DTH2的表达与其在相应的野生型植株中的表达相似。这些结果表明DTH2对于成花素基因的效应独立于Hd1和Ehd1。接下来通过构建T65/NIL F2群体，我们从中分离了16株hd1/ehd1/DTH2-i三突变体，发现三突变体的平均抽穗期比T65晚。综上所述，这些结果表明DTH2是一个新的开花激活因子，在LD条件下诱导开花独立于Hd1和Ehd1通路。
　　2.DTH2中两个功能核苷酸多态和亚洲栽培稻向北扩张相联系
　　我们比较了DTH2-a和DTH2-i的CDS区并发现4个SNPs，其中S3是同义突变，其余是非同义突变。然后我们用这80个地方品种分析这3个SNP和抽穗期的关联，发现S1和S4有显著关联，S2没有关联。为了确定S1和S4的效应，我们构建了4个转基因载体:A1，A2，A3和A4。除了A1转基因，A2，A3和A4都能促进抽穗和种子成熟，其中A4具有最强的促进效应。综上，关联分析和转基因实验表明S1和S4是调控抽穗的功能核苷酸多态(FNPs)。
　　为了研究这些等位基因的进化起源，我们比较了47个野生稻和80个栽培稻的DTH2编码区并作了一个网络分析。基于这两个FNPs的组合，所有等位基因可以分为3组（A1，A2和A4）。其中A1和A2存在于生长在热带和亚热带地区的野生稻、籼稻和爪哇稻中，A4只存在于生长在温带地区的粳稻中。说明A4是一个新产生的等位基因并且在粳稻的驯化或改良中被固定。同时，我们进一步研究这4个等位基因在80个地方品种中的地理分布，DTH2等位基因在栽培稻中的分布和纬度紧密相关，A4等位基因的分布和粳稻的驯化或迁移相平行。结合转基因和关联分析的结果，我们推测A4可能经历了强烈的人工选择，并且对于粳稻在亚洲长日照地区向北扩张起重要作用。
　　为了对这个理论提供额外的证据，我们比较了栽培稻和野生稻的多样性并进行了多种中性检测实验。核苷酸多样性检测表明粳稻的多样性比其他栽培稻和野生稻都低。检测核苷酸多态是否符合中性平衡模型的结果显示，Tajima's D和HKA统计都不显著，偏离中性预期。于是我们检测了DTH2周围20个基因的多样性，结果显示，在粳稻中，20个基因的平均核苷酸多样性比籼稻、爪哇稻和野生稻的多样性都降低。为了检测在粳稻中低的遗传多样性是否由驯化瓶颈效应而不是选择产生的，我们用两个经历瓶颈效应的衍生群体，使用7个中性进化基因，建立了一个溯祖模型进行分析。结果显示在粳稻中，DTH2周围基因的多样性不能仅由驯化瓶颈解释。DTH2周围显著的选择性清除提供了额外的证据证明DTH2在粳稻的驯化和育种中可能经受了人工选择。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 文献综述

1 自然选择、人工选择与适应性

1．1 自然选择

1．2 人工选择

1．3 自然选择和人工选择的异同

1．4 适应性

2 植物与开花相关的适应性基因的克隆和功能分析

2．1 拟南芥FRIGIDA和Flowering Locus C

2．2 玉米Dwarf8

2．3 小麦Ppd-D1

2．4 大麦EARLY MATURITY8

2．5 向日葵HaFT1

3 植物驯化基因的克隆和功能分析

3．1 水稻驯化基因的克隆和功能分析

3．2 其他作物驯化基因的克隆和功能分析

4 栽培稻的起源和分布

4．1 栽培稻的起源种

4．2 栽培稻的起源地和目前分布

5 水稻抽穗期的研究现状

5．1 水稻的抽穗期和光温反应特性

5．2 水稻抽穗期的遗传特性

5．3 水稻抽穗期QTLs的定位

5．4 水稻重要抽穗期基因／QTLs的克隆和功能分析

5．5 水稻光周期开花途径分析

5．6 水稻光周期基因的适应性研究

6 CONSTANS-like转录因子基因家族

7 本研究的目的和意义

第二章 DTH2的图位克隆和功能分析

1 材料和方法

1．1 NIL的分离

1．2 田间栽培

1．3 控制条件下栽培

1．4 性状考察

1．5 DNA提取及PCR

1．6 QTL分析及分子标记开发

1．7 候选基因预测与测序分析

1．8 植物中CO-like基因进化分析

1．9 载体构建

1．10 质粒提取

1．11 植物转化

1．12 GUS组织化学染色

1．13 亚细胞定位

1．14 转录自激活活性分析

1．15 节律表达材料的种植与取样

1．16 RNA提取与Quantitative RT-PCR分析

2 结果与分析

2．1 抽穗期QTL分析和NIL的分离

2．2 表型描述

2．3 DTH2的精细定位

2．4 DTH2的候选基因预测

2．5 转基因功能验证

2．6 DTH2的亚细胞定位

2．7 DTH2的转录自激活活性分析

2．8 DTH2的时空表达模式分析

2．9 DTH2通过上调Hd3a和RFT1的表达来促进抽穗

3 讨论

3．1 微效QTLs的克隆

3．2 CONSTANS-like基因在物种中的功能保守和分化

3．3 DTH2可能是一个新的开花激活因子

第三章 DTH2中的两个功能核苷酸多态和亚洲栽培稻向北扩张相联系

1 材料与方法

1．1 地方品种的种植

1．2 载体构建

1．3 植物转化

1．4 单核苷酸多态和抽穗期的关联分析

1．5 DTH2的测序和网络分析

1．6 序列分析和中性检测

1．7 溯祖模拟

2 结果与分析

2．1 SNPs与抽穗期的关联分析

2．2 功能核苷酸多态分析

2．3 等位基因在亚种间的分布

2．4 等位基因的地理分布

2．5 中性检测

2．6 选择性清除作用分析

2．7 溯祖模拟

3 讨论

3．1 DTH2参与开花时间地区适应和DTH2中的两个FNPs和水稻栽培向北扩张的联系

3．2 微效QTLs在作物适应和育种中的优势

第四章 全文总结

1 抽穗期QTL分析和DTH2的图位克隆

2 DTH2蛋白定位于细胞核内并且具有转录自激活活性

3 DTH2的表达分析

4 DTH2通过上调Hd3a和RFT1来促进抽穗

5 DTH2中两个功能核苷酸多态的鉴定

6 DTH2在栽培和野生稻中的网络和遗传多样性分析

7 本研究的主要创新点

8 研究展望

参考文献

附录

在读期间发表论文

致谢