平头炭疽菌对大豆抗感品种的致病差异及其MAPK基因CtPMK1的功能研究

摘要

大豆(Glycinemax)是重要的经济作物，在农业生产中占有重要地位。由平头炭疽菌[Colletotrichumtruncatum(Schwein.)Andrus&W.D.Moore]侵染引起的大豆炭疽病是世界上大豆产区的重要病害之一，可造成大豆严重减产。因此，炭疽病的防治是大豆生产上的一个重要课题。本研究对田间采集分离到的大豆炭疽病病原菌进行分离鉴定，并从大豆品种的抗性筛选、大豆与炭疽菌的互作、炭疽菌的生长发育及致病分子调控机制等方面进行研究，为认识和掌握该病害发生以及制定有效的防治策略提供生产上和理论上的依据。
　　1、从江苏泰兴和江浦两个农场的大豆田中采集疑似炭疽病标本，经分离、纯化及致病性测定得到41株致病菌。发现这些病原菌主要存在两种菌落生长形态，其中一种与已报道的平头炭疽菌相似，菌落为规则的圆形，边缘整齐，菌丝疏松，幼嫩菌丝为白色，老龄菌丝为灰色;另一种未见有报道，菌落为不规则的圆形，边缘不整齐，气生菌丝少，中部菌丝为白色绒毛状，外围菌丝呈鲜艳的红褐色。从这两种形态的致病菌中分别选取一株致病性强的代表性菌株进行ITS(internaltranscribedspacer)测序，测序结果发现与平头炭疽菌C.truncatum同源性均达到100％。综合形态学和分子生物学方法，将这两类炭疽菌均鉴定为平头炭疽菌，用于后续研究。
　　2、选育和利用抗病品种是防治大豆炭疽病的一种经济有效的方法。明确大豆种质对大豆炭疽病的抗性，是大豆抗病育种的前提条件。本研究采用孢子悬浮液接种离体叶片的方法，选用前面鉴定的两类平头炭疽菌代表性菌株JS11-32和TB8-15，对59份浙江大豆品种进行抗大豆炭疽病鉴定筛选研究，发现:对菌株JS11-32表现抗性的大豆品种占96.61％，对TB8-15表现抗性的品种占55.93％，而且对TB8-15表现抗性的品种对JS11-32均表现抗性。可见浙江大豆种质资源对平头炭疽菌抗性较好，可以尝试将部分抗性品种推广。
　　3、通过台盼蓝染色对表现抗性（即非亲和互作）的大豆品种5D068与作为对照的感病品种（即亲和互作）合丰47进行侵染差异观察。发现:在接种炭疽菌后24h内，两个品种中均出现分生孢子萌发和附着胞的形成;接种48h后，病原菌在感病品种叶片内形成侵染菌丝，而抗病品种叶片则显示类似HR(HypersensitiveReaction)的细胞坏死反应。经DAB染色我们发现在侵染早期，抗病叶片在附着胞下面以及受侵染细胞内产生大量的活性氧(ROS)，甚至周围未侵染细胞边界也有ROS;而感病叶片只在附着胞的周围有少量ROS的产生。
　　4、MAPK信号通路在真核生物中相当保守，在病原真菌感受外界刺激、生长发育与形态建成、孢子产生与萌发等过程中具有非常重要的作用。本研究中，参照已公布全基因组序列的胶孢炭疽C.gloeosporioides和希金斯炭疽Chigginsianum中与Fus3-Kss1类MAPK基因同源的基因序列，设计引物在平头炭疽菌Ctruncatum中克隆到一个同源基因，命名为CtPMK1。该基因编码一个含355个氨基酸的多肽，含有MAPK共有的11个蛋白激酶区域和1个MAPK激酶作用的磷酸化位点(TEY)。该基因敲除导致突变体菌丝生长速率下降、黑色素生成减少以及产孢量显著下降;突变体丧失对大豆叶片的侵染能力，进一步试验观察到突变体分生孢子在洋葱表皮细胞上无法形成附着胞，突变体菌丝顶端也无法形成附着胞类似结构。上述结果表明，CtPMK1参与调控炭疽病菌的侵入，从而影响炭疽菌对大豆的致病性。将Magnaportheoryzae中的PMK1基因互补CtPMK1缺失突变体，表型和致病性均能恢复，说明该类基因在真菌中是很保守的。

目录

声明

摘要

上篇 文献综述

第一章 大豆炭疽病概述

1 分布危害

2 病原菌研究

3 危害症状

4 发病规律

5 防治方法

参考文献

第二章 炭疽菌与寄主互作研究

1 炭疽菌的侵染策略

2 寄主植物的抗病性

参考文献

第三章 植物病原真菌中MAPK信号传导通路的研究

1 MAPK信号途径

2 Fus-Kss1类MAPK

参考文献

下篇 研究内容

第一章 大豆炭疽病病原菌的分离和鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第二章 平头炭疽菌对浙江大豆的致病差异鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第三章 平头炭疽菌MAPK基因CtPMK1的功能研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

附录1 试验所用引物序列

附录2 试验常用培养基

附录3 栗疫病菌凋亡抑制蛋白基因CpBIR1的功能研究

攻读硕士学位期间发表的研究论文

致谢