Surfactin生物合成调控及其工业发酵工艺的研究

摘要

芽孢杆菌能够通过非核糖体合成酶簇(NRPs)生物合成多种具有抑菌、表面活性等的脂肽类次级代谢产物。其中以表面活性素surfactin的生物活性和分子合成机制研究最为深入。Surfactin是由SrfA，SrfB，SrfC三个非核糖体合成酶合成的，是目前发现的降低表面张力能力最强的生物表面活性剂，对其的功能研究发现它还兼具抗细菌、真菌、病毒和支原体的功能，在石油回收、土壤修复、生物防治、食品、化妆品等工业领域上有着广泛的应用前景。尽管有着诸多特性和优势，目前关于surfactin发酵工艺的研究多集中于实验室摇瓶和小型生物反应器水平，产量有限且培养基成本昂贵，发酵设备复杂、分离纯化工艺难以工业化放大生产。
　　在本研究中，以此作为出发菌株研究surfactin生物合成过程中前体的调控作用;优化设计出成本低廉、产量较高的工业发酵培养基，并针对其进行溢流式发酵工艺的研究;此外在对Yoneda培养基进行优化后研究了两阶段通气控制在surfactin发酵中的应用。主要结果描述如下:
　　1.研究了氨基酸前体的添加对surfactin生物合成的影响。研究了氨基酸前体分别单独添加和协同作用对surfactin生物合成的调控作用。通过氨基酸筛选实验发现赖氨酸和甘氨酸能显著提高以菌体干重为基准的surfactin生成系数(YP/X)，二者分别为0.46和0.5，比对照组分别提高39％和51％。在针对surfactin肽环的组成氨基酸亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸、甘氨酸在不同培养阶段的添加对surfactin生产的影响的研究中发现:除谷氨酸外，其余五种氨基酸均能在较低添加浓度(0.75-1mM)时显著促进菌体生长，该促进作用在发酵中后期添加时更加显著。缬氨酸、谷氨酸和天冬氨酸对surfactin产量的提高作用不明显，缬氨酸严重抑制surfactin的生产。通过空间填充实验设计对各种氨基酸的添加进行优化，最终将surfactin的总产量提高24％，数据分析表明各氨基酸之间对于surfactin生产的影响并无交互作用，这首次在发酵水平上证实了氨基酸前体对surfactin的分子合成机制和调控作用。
　　2.研究了碳架前体对surfactin生物合成的影响及其与TCA循环关系。经筛选草酸、琥珀酸钠、柠檬酸钠等糖代谢中间体时surfactin的YP/X均高于对照组，显著提高surfactin的合成效率，首次发现了surfactin生物合成途径与TCA循环联系紧密。进一步的添加试验发现在发酵24h后添加碳架前体能在不同程度上提高surfactin的产量和YP/X。对各碳架进行优化设计并未能显著提高surfactin的整体产量。
　　3.利用田口方法对surfactin工业发酵培养基进行了优化。通过田口方法发现培养基中玉米粉、PO43-和硝酸铵在不同的设计中对surfactin的生产分别具有极显著的影响，并就此针对这三个因素进行进一步的实验设计，最终取得了高产培养基配方为:玉米粉为35g/L，硝酸铵为15g/L，尿素6g/L，KCl1.47g/L，NaH2PO4·2H2O20mM，CaCl20.5μM,MgSO4·7H2O0.1mM,FeSO4·7H2O1μM,MnSO4·H2O0.5mM,CuSO4·5H2O12.8μM。该培养基营养全面、成本低廉、pH缓冲能力强，surfactin产量高达2.3g/L，是原始Landy培养基的近2倍，与优化后的Landy相比提高15‰且本培养基配方具有较高信噪比，产量稳定。此外，根据当前市场价格计算，可为surfactin生产降低培养基成本40％以上。利用此工业培养基进行5m3发酵罐放大发酵生产，获得surfactin产量达到4400mg/L。
　　4.建立了surfactin泡沫溢流发酵中参数控制与泡沫形成的关联控制。在批次发酵中发现搅拌和通气速率与细胞生长和surfactin生产有密切关系。在不同的搅拌和通气速率控制策略下，surfactin生产呈现出了不同的动态趋势。在控制3中，通过控制泡沫溢流速度低于0.7L/h，泡沫中富集的surfactin浓度呈直线上升趋势，表明可能通过控制搅拌速度和通气速率提高surfactin浓缩。在进一步的研究的中发现搅拌和通气速率分别对溢流速度和surfactin浓度影响显著时期是在不同的发酵阶段。Surfactin富集浓度最高出现在发酵21小时，搅拌速度为150rpm和通气率是1vvm的条件下。通过补料并控制surfactin泡沫溢流速度在0.2L/h，成功实现了全实现了surfactin的持续溢流发酵，并将泡沫中的浓度维持在4000mg/L。
　　5.针对surfactin发酵进行了Yoneda培养基的优化及两阶段通气控制。通过部分析因实验设计筛选出Yoneda培养基中黄豆粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁对于Bacillusamyloliquefaciensfmb50产surfactin影响显著，进一步的正交试验获得的优化后的培养基配方为黄豆粉100g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾9g/L，硫酸镁0.6g/L，氯化钙0.1g/L，硫酸亚铁0.01g/L，硫酸锰0.05g/L。采用该优化后培养基生产surfactin，在摇瓶发酵中获得的最高产量为3321.3mg/L。在10L发酵罐中获得的最高产量为2024mg/L，比同等条件下Landy培养基产量提高5.4倍。进一步对该优化培养基进行两阶段通气控制发酵时，surfactin的产量达到3362mg/L，比对照组提高66％。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 芽孢杆菌产抗菌脂肽的种类、结构及应用

1．2 抗菌脂肽的生物合成及调控机理

1．3 抗菌脂肽发酵生产工艺的研究进展

1．3．1 发酵培养基优化

1．3．2 发酵过程控制

1．3．3 廉价、可再生资源作为基质的应用

1．3．4 固体载体的添加

1．3．5 固态发酵

1．3．6 脂肽的泡沫溢流式发酵

1．3．7 固定化细胞发酵

1．4 本研究的意义和目的

参考文献

第二章 氨基酸前体对surfactin生物合成的影响

1．材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果与讨论

2．1 不同氨基酸的添加对surfactin生产的影响

2．2 氨基酸前体的添加时间和添加量对surfactin生产的影响

2．3 氨基酸前体的添加的优化设计

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第三章 碳架前体对surfactin生物合成的影响

1．材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果与讨论

2．1 不同碳架的添加对surfactin生产的影响

2．2 代谢中间体碳架的添加对surfactin生产的影响

2．3 前体碳架的添加对surfactin生物合成的影响

2．4 碳架添加量的优化

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第四章 Surfactin工业发酵培养基的田口实验设计优化

1．材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果与讨论

2．1 工业碳、氮源的筛选

2．2 尿素和硝铵对surfactin生产的影响

2．3 离子缺失培养对细胞生长和surfactin生产的影响

2．4 不同营养物质浓度对surfactin生产影响的单因素实验

2．5 surfactin工业发酵培养基的田口优化

2．9 工业发酵培养基的放大发酵

3．讨论

4 本章小结

参考文献

第五章 Surfactin溢流式发酵中搅拌转速和通气率控制的研究

1．材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果与讨论

2．1 菌体干重(DCW)与菌落形成单位数(CFU)的标准曲线

2．2 不同控制条件发酵过程分析

2．3 不同控制条件下的细胞比生长速率μ

2．4 不同控制条件下的溢流泡沫中surfactin的比合成速率qp

2．5 搅拌转速和通气率对溢流泡沫中surfactin浓度的影响

2．6 控速溢流下的补料流加培养

3．讨论

4．本章小结

参考文献

第六章 Yoneda培养基的优化及两阶段通气控制的研究

1．材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果与分析

2．1 部分析因实验设计关键因子的筛选

2．2 对Yoneda培养基进行进一步优化

2．3 Yoneda培养基的发酵及两阶段通气控制的研究

3．讨论

4．本章小结

参考文献

全文结论

创新点

硕士期间发表文章

致谢