猪徒手克隆技术的优化及Tet1在早期胚胎发育中的变化

摘要

随着生物技术的不断发展，体细胞克隆作为一种技术手段已经被广泛应用于转基因动物、物种保护、家畜繁育、异种器官移植以及疾病模型的研究，但是克隆效率低下一直阻碍这一技术发展。一般认为克隆效率低下与重构胚不正确或者不完全的重组而导致的错误表观修饰相关，其中最主要的就是DNA甲基化异常和组蛋白修饰错误。因此如何提高克隆效率对推动这一技术发展有着重要的意义。
　　1.徒手克隆技术的优化
　　为提高徒手克隆效率，我们在徒手克隆过程中对克隆胚重构以及胚胎移植都进行了优化。结果发现优化后的囊胚率能达到40％左右，并将235枚桑椹胚及囊胚移植到3头自然发情后4到5天的受体母猪子宫角内，并使两头受体母猪成功怀孕，虽然1头母猪中途不幸流产，但另1头母猪在妊娠后第114天自然分娩产下8只小猪，相对与其他实验室的克隆产子率明显提高。
　　2.卵母细胞成熟过程及孤雌激活后胚胎发育中Tet1的免疫荧光染色
　　实验选取成熟0h(GV)、12h、24h、36h和MⅡ时期脱完卵丘的卵母细胞以及孤雌激活（物理+化学）后7.5h.12h、15h、24h和2-cell(36h)胚胎用PFA固定后进行免疫荧光染色。结果发现在卵母细胞成熟过程中及PA后胚胎早期发育过程中，Tet1在不同阶段出现不同的表达。结果表明Tet1可能在卵母细胞成熟过程及孤雌激活后胚胎发育中起着调控作用，但有待进一步研究。
　　3.5-aza-CdR对卵母细胞成熟过程中和胎儿成纤维细胞甲基化相关基因表达的影响
　　实验对成熟培养的卵母细胞进行不同浓度5-aza-CdR处理32-34h和传代培养24h的梅山猪胎儿成纤维细胞进行不同浓度5-aza-CdR处理48h后收样提RNA反转录并进行定量PCR。结果发现无论是卵母细胞还是胎儿成纤维细胞经不同浓度5-aza-CdR后不仅Dnmts的表达水平有显著变化，Tet蛋白家族的表达水平也发生显著变化，结果表明Dnmts与Tet蛋白家族可能存在互作。

目录

论文说明

声明

摘要

英文缩略词表(ABBREVIATION)

第一章 文献综述

综述1、影响体细胞核移植效率的因素

1．1 卵巢及其来源

1．2 供体细胞

1．3 徒手克隆的流程与注意事项

1．4 受体母猪与胚胎移植

参考文献

综述2 5-aza-CdR在体细胞核移植中的应用及甲基化相关基因的研究

2．1 DNA甲基转移酶的基本作用与特征

2．2 5-aza-CdR对胚胎发育的影响

2．3 Tet蛋白家族的结构与功能

2．4 Tet蛋白家族的生物学作用

2．5 Dnmts与Tet蛋白家族关系

参考文献

第二章 实验研究

第一节 徒手克隆技术的优化

1 材料与方法

2 结果

3 分析与讨论

参考文献

第二节 Tet1在早期胚胎发育中的变化

1 材料与方法

2 结果

3 分析与讨论

参考文献

全文结论

致谢