血红素加氧酶1介导氢气和抗坏血酸增强紫花苜蓿非生物胁迫耐性的分子机理

摘要

近年来，动物中的研究表明氢气（hydrogengas，H2）可以作为重要的信号分子调节动物抗氧化、抗炎症和抗凋亡的能力，然而其在植物中的功能及信号转导途径尚不明确;此外，抗坏血酸(ascorbicacid，AsA)在缓解镉胁迫中起到重要的作用，但是AsA作用的机制和相关信号通路仍不清楚。因此，我们针对上述问题展开了研究，取得了以下的主要结果:
　　1、百草枯(paraquat，PQ)胁迫可以诱导紫花苜蓿幼苗内H2的产生。当以富氢水(hydrogen-richwater，HRW)的形式给植物供给H2，发现HRW可以显著增强紫花苜蓿对PQ造成的氧化伤害的耐性;主要表现为HRW处理可以缓解PQ对幼苗根生长的抑制、减少脂质过氧化和降低组织中过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2-)的含量。另外，H2可以诱导细胞内一些代表性抗氧化酶的活性与转录本。进一步的研究发现，H2预处理可以显著增加紫花苜蓿血红素加氧酶1（HO1）基因的表达水平、蛋白含量和HO酶活性;H2的缓解作用可以被HO活性抑制剂锌原卟啉Ⅸ(zincprotoporphyrinⅨ，ZnPP)所抑制，而这种抑制作用又能被HO1催化反应产物一氧化碳(carbonmonoxide，CO)所逆转。此外，我们还发现H2预处理可以增强紫花苜蓿对其它多种环境胁迫的耐性。这些结果暗示着H2可能是紫花苜蓿抵御环境胁迫过程中的一个重要的信号分子，并可能通过HO1介导其保护作用。
　　2、脱落酸(abscisicacid，ABA)和干旱胁迫可以显著诱导紫花苜蓿组织中H2的产生。以HRW的形式给紫花苜蓿供给H2可以显著增强其对外源ABA的敏感性，包括种子的发芽率、根的伸长和气孔关闭;同时HRW处理的幼苗中H2O2含量在有外源ABA处理或受到水分胁迫时显著的比未处理的高，并能增强紫花苜蓿对干旱胁迫的耐性。进一步的药理学实验表明，NADPH氧化酶抑制剂二甲基苯碘(diphenyleneiodonium，DPI)和H2O2化学清除剂N，N'-二甲基硫脲（N，N'-dimethylthiourea，DMTU）可以抑制HRW对紫花苜蓿幼苗干旱胁迫耐性的增强作用。随后研究发现，HRW和干旱处理可以显著提高紫花苜蓿幼苗叶片质外体的pH;使用H+-ATPase抑制剂钒酸盐(vanadate)进行处理，结果表明vanadate可以显著缓解H2对质外体汁液pH的碱化作用和增加气孔对ABA和缺水敏感性的作用。以上结果表明H2调节质外体汁液pH和气孔关闭通过一条依赖于ABA信号途径的机制，并暗示H2可能是紫花苜蓿ABA依赖的干旱胁迫响应中新的正调控因子。
　　3、镉（cadmium，Cd）胁迫导致紫花苜蓿幼苗受到严重的氧化伤害并显著降低组织内AsA含量;外源添加AsA不仅可以增加幼苗内源AsA的含量，而且可以进一步促进镉诱导HO1表达和活性;此外，AsA可以降低幼苗根部对镉的积累和镉胁迫造成的氧化伤害。HO1的抑制剂ZnPP可以抑制AsA的上述作用，外源添加HO1两个催化反应产物50％饱和CO水溶液或胆红素(bilirubin，BR)可以逆转ZnPP的抑制作用。AsA对抗氧化酶的诱导作用也可以被ZnPP所抑制，并可以被CO逆转。综上所述，AsA的细胞保护作用至少一部分是通过HO1诱导的抗氧化系统和降低Cd积累发挥的。

目录

声明

摘要

缩略语词表

第一章 文献综述

1．1 植物抗逆研究现状

1．1．1 常见非生物胁迫种类及对植物的影响

1．1．2 植物适应逆境胁迫的机制研究

1．1．3 结语

1．2 血红素加氧酶的研究进展

1．2．1 HO基因的克隆与蛋白结构

1．2．2 植物HO生理功能

1．2．3 结语

1．3 氢气生理功能的研究进展

1．3．1 氢气在动物体内的生理功能

1．3．2 氢气在植物中的生理功能

1．3．3 结语

1．4 抗坏血酸在植物中功能的研究进展

1．4．1 在植物生长和发育中的作用

1．4．2 酶的辅因子

1．4．3 植物的抗氧化能力

1．4．4 重金属的转移和去毒

1．4．5 在胁迫防御中的作用

1．4．6 结语

1．5 本研究的目的和意义

1．6 本研究的工作假说与技术路线

第二章 氢气增强紫花苜蓿非生物胁迫耐性的机理

2．1 材料与方法

2．1．1 试剂

2．1．2 H2含量的测定

2．1．3 富氢水(HRW)的制备

2．1．4 植物材料和生长条件

2．1．5 TBARS含量测定

2．1．6 组织化学染色

2．1．7 抗氧化酶活性测定

2．1．8 凝胶电泳

2．1．9 转录本测定

2．1．10 HO1蛋白印记分析

2．1．11 RWC

2．1．12 种子萌发实验和根生长测定

2．1．13 气孔孔径测量

2．1．14 使用荧光探针检测H2O2信号

2．1．15 质外体pH测定

2．1．16 统计分析

2．2 结果与分析

2．2．1 氢气诱导血红素加氧酶1缓解除草剂百草枯胁迫

2．2．2 氢气通过调节叶片质外体pH正调控紫花苜蓿ABA依赖的干旱胁迫响应

2．3 讨论

2．3．1 氢气诱导血红素加氧酶1缓解除草剂百草枯胁迫

2．3．2 氢气通过调节叶片质外体pH正调控紫花苜蓿ABA依赖的干旱胁迫响应

第三章 抗坏血酸通过诱导血红素加氧酶1缓解镉胁迫

3．1 材料与方法

3．1．1 试剂

3．1．2 植物材料、培养条件和处理

3．1．3 TBARS含量测定

3．1．4 AsA含量测定

3．1．5 组织化学染色分析

3．1．6 镉含量测定

3．1．7 HO活性分析

3．1．8 转录本测定

3．1．9 统计分析

3．2 结果与分析

3．2．1 镉胁迫下紫花苜蓿组织内TBARS和AsA含量的变化

3．2．2 AsA或hemin可以缓解镉对紫花苜蓿幼苗造成的氧化伤害

3．2．3 AsA可以诱导HO1含量的上升

3．2．4 AsA的保护作用可以被HO1抑制剂ZnPP所抑制

3．2．5 抗氧化酶基因转录本的分析

3．3 讨论

全文讨论与结论

创新点及展望

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致谢