醚苯磺隆共代谢降解菌MB-1的筛选、降解特性及其固定化研究

摘要

醚苯磺隆属于磺酰脲类除草剂，磺酰脲类除草剂由于其用量少(2～75g.hm-2)、高效、广谱、低毒、低残留和高选择性等优点，而被广泛大量使用，并成为世界第二大类除草剂，对推动农业的发展起了重要的作用。但是磺酰脲除草剂的选择性强且残留性高，在长期施用后其残留问题给农业造成巨大损失。微生物降解具有费用省、环境影响小、可最大限度降低污染物浓度等优点而成为磺酰脲除草剂的重要降解方式。
　　本文从取自生产醚苯磺隆的农药厂的污水处理系统的活性污泥中，分离得到一株能以葡萄糖为生长能源的同时共代谢降解醚苯磺隆的降解菌株，命名为MB-1。根据其菌落特征、生理生化特性，结合菌株的16S rDNA基因序列同源性比较，最终鉴定菌株MB-1为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。
　　菌株在LB培养基中培养4～10h时为生长对数期，10h以后，逐渐进入稳定期，在12h时，菌体生长量最大;菌株的最适生长pH范围和温度分别为6.0～9.0，35℃;菌的生长量随着装液量的增多而减少，且振荡条件下菌的生长比静置培养时菌的生长要好;NaCl浓度在0～10g/L的范围内菌株MB-1的生长情况并没有明显的差别，当NaCl浓度在15～30g/L的范围内时，菌的生长受到抑制，且菌的生长随着NaCl浓度的增加而降低。有较好的耐盐性;菌株MB-1对庆大霉素和氯霉素较为敏感，对羧苄青霉素、盐酸四环素、链霉素、卡那霉素和氨苄青霉素均有抗性。
　　经过饥饿处理后的菌株MB-1，其对醚苯磺隆的降解能力并不能得到改善;通过对菌株MB-1共代谢醚苯磺隆的条件进行优化实验得到，菌株MB-1对醚苯磺隆的最佳共代谢降解的条件为:共代谢基质为浓度2000mg/l的葡萄糖，醚苯磺隆浓度为200mg/l，且排除了菌株大量生长对醚苯磺隆的吸附作用;不同接菌量并不会对菌的生长和醚苯磺隆的降解产生影响;硫酸铵浓度为500mg/l;氯化钠浓度1.0g/l，初始pH和温度分别为6.0和35℃。所有试验金属离子（除Cu+、Mn2+）浓度为0.1mM/L时，均能促进菌株MB-1对醚苯磺隆的降解;浓度为1.0mM/L时，对菌株MB-1降解醚苯磺隆产生抑制作用，其中作用效果最明显的为Co2+。经过HPLC-MS检测，醚苯磺隆共代谢的产物有2-氨基-4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪、甲基{[2-（2-氯乙氧基）苯基]磺酰基}氨基甲酸叔丁酯和4-[（{[2-（2-氯乙氧基）苯基]磺酰基}氨基甲酰基）氨基]-6-甲基-1，3，5-三嗪-2甲酯三种，根据HPLC-MS结果推测菌株MB-1对醚苯磺隆的降解首先发生水解作用，导致脲桥在两个氨基处分别断裂生成2-氨基-4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪以及物质D，物质D不稳定，很快转化为甲基{[2-（2-氯乙氧基）苯基]磺酰基}氨基甲酸叔丁酯;三嗪环上的甲氧基被羟基取代后与甲酸生成4-[（{[2-（2-氯乙氧基）苯基]磺酰基}氨基甲酰基）氨基]-6-甲基-1，3，5-三嗪-2甲酯，甲酸可能来自菌株的生长过程。
　　对菌株MB-1分别采用海藻酸钠和聚乙烯醇(PVA)进行固定化，并通过正交实验得到两种固定化的最佳条件分别为:(1)以海藻酸钠为载体的MB-1包埋固定化的最佳条件为海藻酸钠浓度是4％，CaCl2的浓度为2％，接菌量为1％，钙化时间为4h;(2)以聚乙烯醇为载体的MB-1包埋固定化的最佳条件为聚乙烯醇10％，海藻酸钠浓度是1％，接菌量为1％，CaCl2的浓度为2％，前交联时间为1h，后交联时间4h，Na2SO4的浓度为0.5mol/L。MB-1的固定化小球随着利用次数的增加其对醚苯磺隆的降解率有所降低。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 磺酰脲类除草剂的发展状况

1．2 磺酰脲类除草剂的分子结构及其作用机理

1．3 磺酰脲除草剂的环境问题

1．4 磺酰脲除草剂的降解机制

1．4．1 磺酰脲除草剂的光解

1．4．2 磺酰脲除草剂的化学水解

1．4．3 磺酰脲除草剂的微生物降解

1．4．4 有机物的共代谢降解

1．4．5 微生物降解的影响因素

1．5 醚苯磺隆的简介

1．5．1 醚苯磺隆的结构及其物理化学特性

1．5．2 毒性

1．5．3 国内外研究进展

1．6 本课题的研究意义以及研究内容

1．6．1 研究意义

1．6．2 研究内容及技术路线

第二章 醚苯磺隆降解菌的分离、筛选与纯化

2．1 材料与检测方法

2．1．1 培养基与试剂

2．1．2 醚苯磺隆含量的测定

2．2 实验方法

2．2．1 降解菌株的富集、分离与纯化

2．2．2 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定

2．2．3 降解菌株16S rDNA基因序列测定与分析

2．2．4 降解菌株系统发育定位

2．3 结果与分析

2．3．1 降解菌株的分离筛选及其效果验证

2．3．2 菌株MB-1的菌落形态、生理生化特征

2．3．3 基于16S rDNA基因序列的系统发育分析

2．4 讨论

2．5 本章小结

第三章 醚苯磺隆降解菌MB-1的生长特性研究

3．1 材料与检测方法

3．1．1 培养基与试剂

3．1．2 菌种制备及菌体生长量的测定方法

3．2 实验方法

3．2．1 菌株生长曲线的测定

3．2．2 初始pH值对菌株MB-1生长的影响

3．2．3 温度对菌株MB-1生长的影响

3．2．4 通气量对菌株MB-1生长的影响

3．2．5 NaCl浓度对菌株MB-1生长的影响

3．2．6 菌株MB-1对抗生素的耐受性

3．3 结果与分析

3．3．1 MB-1在LB培养基中的生长曲线

3．3．2 pH值对菌株MB-1生长的影响

3．3．3 温度对菌株MB-1生长的影响

3．3．4 装液量对菌株MB-1生长的影响

3．3．5 NaCl浓度对菌株MB-1生长的影响

3．3．6 菌株MB-1对抗生素的耐受性

3．4 讨论

3．5 本章小结

第四章 醚苯磺隆共代谢降解菌MB-1的共代谢条件的优化

4．1 材料与测定方法

4．1．1 培养基与试剂

4．1．2 菌种制备以及菌体生长量的测定方法

4．1．3 醚苯磺隆含量检测方法

4．2 实验方法

4．2．1 碳饥饿实验

4．2．2 共代谢基质的选择

4．2．3 菌株MB-1对醚苯磺隆的吸附效果检验

4．2．4 葡萄糖浓度的优化实验

4．2．5 醚苯磺隆初始浓度的优化实验

4．2．6 接菌量的优化实验

4．2．7 硫酸铵浓度的优化实验

4．2．8 氯化钠浓度的优化实验

4．2．9 初始pH的优化实验

4．2．10 温度的优化实验

4．2．11 菌株MB-1在优化条件下利用醚苯磺隆的生长降解曲线

4．2．12 金属离子对菌MB-1降解醚苯磺隆的影响

4．2．13 浅探醚苯磺隆的降解途径

4．3 结果与分析

4．3．1 碳饥饿实验的结果

4．3．2 共代谢基质的选择结果

4．3．3 菌株MB-1对醚苯磺隆的吸附效果检验的结果

4．3．4 葡萄糖浓度的选择

4．3．5 醚苯磺隆初始浓度的选择

4．3．6 接菌量的选择

4．3．7 硫酸铵浓度的选择

4．3．8 氯化钠浓度的选择

4．3．9 初始pH的优化实验结果

4．3．10 温度的优化实验结果

4．3．11 菌株MB-1在优化条件下利用醚苯磺隆的生长降解曲线

4．3．12 金属离子对菌MB-1降解醚苯磺隆的影响

4．3．13 醚苯磺隆的降解途径

4．4 讨论

4．5 本章小结

第五章 MB-1降解菌的细胞固定化研究

5．1 材料与测定方法

5．1．1 供试菌株

5．1．2 培养基与试剂

5．1．3 醚苯磺隆的测定

5．1．4 种子液的制备

5．1．5 MB-1固定化小球对醚苯磺隆的降解

5．2 以海藻酸钠为载体的包埋固定化

5．2．1 以海藻酸钠为载体的固定化小球的制备

5．2．2 海藻酸钠包埋条件的确定

5．2．3 以海藻酸钠为载体的包埋固定化结果与分析

5．3 以聚乙烯醇(PVA)为载体的包埋固定化

5．3．1 以聚乙烯醇(PVA)为载体的固定化小球的制备

5．3．2 聚乙烯醇(PVA)包埋条件的确定

5．4 两种固定化小球的稳定性研究

5．4．1 两种固定化小球的稳定性实验方法

5．4．2 两种固定化小球的稳定性结果

5．5 讨论

5．6 本章结论

第六章 全文总结与展望

6．1 全文总结

6．2 创新点与不足

6．2．1 创新点

6．2．2 不足之处

6．2．3 研究展望

参考文献

致谢

研究中获得的相关DNA序列