蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum CH-1细胞骨架相关基因的研究

摘要

螺原体属于柔膜菌纲，不似其他细菌有细胞壁，但是它仅靠单层膜即能维持螺旋状的特殊形态和运动形式，它是研究运动性的模式生物，研究它的形态和运动对深入了解生物的基本规律有极其重要的意义。细胞的形态和运动方式与其细胞骨架有关，fib基因是螺原体中特有的基因，其编码的Fib蛋白是螺原体细胞骨架的主要组成部分。mreB基因是编码细胞骨架蛋白的相关基因之一，其编码的MreB蛋白有维持螺原体独特的螺旋细胞结构的作用。因此研究螺原体细胞骨架相关基因mreB、fib有助于进一步认识螺原体的形态变化和运动的机制。本研究在测定蜜蜂螺原体Spiroplasmamelliferum CH-1基因组序列的基础上，应用生物信息学方法分析细胞骨架相关基因mreB和fib、研究mreB基因的外源表达情况，以及螺原体在非螺旋状和螺旋状时mreB、fib基因的表达差异，为今后深入研究MreB体外聚合作用，进一步研究其在体内的聚合特点，以及mreB、fib基因的功能分析奠定基础。主要研究结果有:
　　第一、螺原体CH-1中含有5个mreB基因、1个fib基因，利用生物信息学的方法，对mreB1-mreB5和fib所编码的蛋白质进行分析，结果表明:(1) MreB1-MreB5的分子量分别为36、23、23、37、25 kD，其中MreB1的分子量与其他细菌（如Escherichia coli)中的分子量一致，均为36kD，预测Fib分子量为58 kD，与其他研究者所报道的大小相似;(2) MreB蛋白属于MreB/Mbl蛋白质家族，Fib蛋白的N端（14-226的氨基酸位置）预测属于磷酸化酶家族(Phosphorylase superfamily)，与Cohen-Krausz等的预测结果相似。(3)利用SWISS-MODEL自动同源建模，预测了螺原体CH-1 MreB蛋白的三维立体结构，发现MreB1、MreB4、MreB5的蛋白结构相似，有细微的差异，MreB2和MreB3的蛋白结构相近，存在较小差异。Fib由于是螺原体中独特的蛋白，并不能根据同源建模的方法得到整个蛋白的三维结构。(4)S.melliferum CH-1的MreB氨基酸与其他细菌的系统发育树显示，MreB1-MreB5分别与其他螺原体相对应的MreB蛋白亲缘关系较近。
　　第二、根据螺原体CH-1全基因组测序得到的细胞骨架相关基因mreB序列设计引物，首次克隆了螺原体的mreB1-mreB5基因，利用大肠杆菌表达系统(表达质粒为pET-28a)表达纯化了MreB蛋白。在蛋白纯化时发现E coil所表达的螺原体CH-1MreB1-MreB5目的蛋白存在于包涵体之中，需用含8 mol/L尿素的Binding Buffer才能溶解，属于疏水性蛋白质，结合生物信息学分析，推测表达的螺原体CH-1中的MreB蛋白可能都是疏水性蛋白，为今后研究MreB体外聚合作用以及进一步研究其在体内的聚合特点奠定基础。
　　第三、螺原体CH-1在培养过程中形态有明显的变化，用暗视野显微镜观察在延滞前期绝大部分螺原体成小点状，对数生长期螺原体绝大多数呈螺旋状，而在电镜下观察暗视野显微镜下成小点状的螺原体则呈各种不规则的近球形，或末端膨大的稍弯曲的杆状。利用二步法的real-time PCR方法，以SYBR GreenⅠ染料法相对定量螺原体CH-1在螺旋状和非螺旋状时mreB1-mreB5、fib基因的表达，结果表明:(1)mreB1-mreB5和fib基因在非螺旋状时的表达量相对于螺旋状时表达量存在显著差异。螺原体在典型的螺旋形时，mreB、fib基因的表达量比螺原体在非螺旋状时表达量显著提高，初步表明螺原体CH-1维持螺旋形需要mreB和fib基因的参与，这些细胞骨架相关基因可能与螺原体的形态相关;(2)螺原体从非螺旋状生长到螺旋状期间，fib基因表达的增幅水平大于mreB基因表达的增幅水平。推测对于螺原体CH-1螺旋形态的维持fib基因可能比mreB基因作用明显，所以mreB、fib基因的功能有待进一步验证。
　　本研究结果为今后进一步确定这些基因在蜜蜂螺原体CH-1形态和运动性方面的作用提供了重要信息，为进一步研究基因的功能奠定基础。

目录

声明

论文说明

本文中主要名词汇总

摘要

文献综述

一、螺原体(spiroplasma)的研究概况

1．螺原体的基本生物学特性

2．国内外螺原体的研究

二、细胞骨架的研究进展

1．细菌细胞骨架研究概况

2．螺原体细胞骨架的结构与组成

3．细胞骨架与螺原体的形态及运动

4．原核细胞骨架相关基因的克隆表达

三、螺原体的遗传操作系统

1．随机插入突变

2．同源重组突变

3．可诱导的启动子系统

4．转化方法

5．转化后培养方法

6．突变株验证方法

四、本研究的主要内容、目的及意义

参考文献

第一章 蜜蜂螺原体CH-1细胞骨架相关基因mreB1-mreB5、fib的生物信息学分析与克隆表达

第一节 蜜蜂螺原体CH-1 mreB1-mreB5、fib序列的生物信息学分析

前言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结与讨论

参考文献

第二节 蜜蜂螺原体CH-1 mreB基因的克隆与表达

前言

1 材料与方法

2 结果与分析

3．小结与讨论

参考文献

第二章 螺原体CH-1细胞骨架相关基因mreB、fib在螺原体二种不同形态时的表达量差异

前言

1 材料与方法

1．1 菌株和试剂

1．2 暗视野显微镜及透射电镜下观察螺原体CH-1的螺旋和非螺旋形态

1．3 设计real-time PCR所用引物

1．4 螺原体总RNA的提取

1．5 RNA浓度的测定

1．6 反转录反应

1．7 Real-time PCR

2 结果与分析

2．1 螺原体CH-1生长过程中的形态变化

2．2 基因mreB、fib在螺原体CH-1二种不同形态时的表达量差异

3．讨论

参考文献

全文总结

一、本文主要研究结果

二、本文的主要创新点

三、尚待解决的问题

附录

攻读硕士期间发表的学术论文

致谢