炎症状态下GR对猪TLR2、4表达的调控

摘要

天然免疫，作为机体抵抗病原入侵的第一道防线，可在病原感染之初迅速调动机体防御系统。天然免疫这种强大功能的激活，主要依靠Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)对病原进行识别，继而激活补体系统，诱导细胞因子、化学增活素等天然免疫效应分子的分泌，调动NK细胞和吞噬细胞，从而对病原进行应答。病原入侵也可激活HPA轴(Hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)对天然免疫进行调控。糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor，GR）作为应激反应的效应器，可以对TLR信号通路进行调控。许多研究表明，GR可以在转录水平上以“蛋白-基因”、“蛋白-蛋白”等模式，对TLR所介导的信号分子进行转录调控从而抑制炎症反应。尽管如此，GR作为转录因子，直接对TLR进行转录调控的研究较少。
　　众所周知，病原感染以及疫苗免疫会激发机体对病原产生特异性免疫反应。尽管如此，猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）感染后GR是否直接对猪肺脏TLR2进行转录调控，以及疫苗免疫是否对此产生干扰作用，目前还不清楚。另一方面，现代养殖场的很多管理方式都会诱使家畜产生应激。许多研究采用ACTH长时间处理动物来模拟慢性应激反应，而使用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）处理动物可模拟病原菌感染所诱导的急性炎性反应。ACTH预处理所模拟的慢性应激，是否会通过影响TLRs/GR的交互作用干扰LPS在猪组织局部诱导炎症反应，目前尚不清楚。
　　本课题在猪肺炎支原体感染动物模型以及LPS诱导的炎症反应动物模型中，研究了GR对TLR2/4的转录调控机制，以及疫苗免疫或ACTH预处理对这种转录调控的影响。本论文分为三大主要部分。
　　1.猪肺炎支原体感染状态下猪肺脏GR对TLR2的调控以及疫苗免疫的影响
　　本试验从5窝猪群（约克×梅山）中选取15头15d仔猪（每窝3头），并将其随机分为三组，分别为对照组(CC);未免疫感染组(NI);免疫感染组猪(VI)。VI组猪通过颈部肌肉注射1 mL猪肺炎支原体疫苗，其它两组猪（CC和NI组）以相同的方式模拟注射等量PBS。一个月后，VI和NI组猪经气管注射2 mL攻毒株(109CCU/mL)，而CC猪以相同的方式模拟注射等量PBS。研究结果显示，NI组猪出现支原体感染的典型肺炎病理损伤，肺损伤评分显著高于VI组（P＜0.05），疫苗免疫可以显著缓解猪肺炎支原体感染引起的临床症状以及肉眼可见的肺脏损伤，而对照组没有出现明显的临床症状和肺脏病理变化。尽管如此，NI和VI组猪肺脏支原体DNA的含量分别为104.14 copies/mL和103.67 copies/mL，均极显著高于对照组（P＜0.01），疫苗免疫没有改变肺脏猪肺炎支原体DNA含量。NI组以及VI组猪血清皮质醇水平分别为52.2 ng/mL和33.8 ng/mL，均极显著低于CC组（CC组为76.8 ng/mL;P＜0.01），但只有VI组GR在核内的表达显著低于CC组（P＜0.05）。TLRs1～10均在猪肺脏中有表达，其中TLR2的表达量最高。NI组猪TLR2 mRNA的表达上调(P＜0.05)，而VI组无明显的变化。使用染色质免疫共沉淀技术，发现NI组猪GR与TLR2启动子的结合上调（P＜0.05），但VI组猪呈下调趋势。这表明猪肺炎支原体疫苗免疫，可能通过抑制GR核转移以及GR与TLR2启动子的结合，从而抑制肺TLR2的基因转录。
　　2.LPS处理状态下GR对猪肺脏TLR表达的调控以及慢性应激的影响
　　24头三元杂交（杜洛克×长白×大白）雄性仔猪，平均体重为12±0.5 kg，随机分为4个处理组，每组6头猪，分别为空白对照组(CC);无ACTH预处理的LPS注射组(LPS);ACTH单独注射组(ACTH);有ACTH预处理的LPS注射组(ACTH+LPS)。ACTH以及ACTH+LPS组猪连续两天肌肉注射ACTH（2.25 IU/kg体重），每隔6小时注射一次，共注射7次，其余两组在相同时间点等体积注射生理盐水。最后一次ACTH注射后6h，向LPS组以及ACTH+LPS组猪肌肉注射LPS（15μg/kg体重），其余两组以相同方式注射等体积生理盐水。研究结果发现，无ACTH预处理时LPS显著上调了血清肿瘤坏死因子（TNF）-α以及肺脏IL-1β mRNA、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达水平(P＜0.05)，但对肺脏白细胞介素(IL)-6、TNF-α以及环氧合酶(COX)-2mRNA的表达无显著影响;ACTH预处理对LPS所诱导的肺脏炎症因子的表达无显著影响;ACTH单独处理对这些促炎因子的表达无显著影响。无ACTH预处理时LPS显著下调了肺脏皮质醇水平（P＜0.05）;ACTH预处理对LPS的处理效果无显著作用;与对照组相比，ACTH单独处理引起皮质醇的水平下调（P＜0.05）。无ACTH预处理时LPS显著上调了TLR2 mRNA表达(P＜0.05);ACTH预处理对LPS的处理效果无显著影响。无ACTH预处理时LPS有下调总GR表达的趋势(P=0.089);ACTH预处理对LPS的处理效果无显著作用;与对照组相比，ACTH单独处理也可显著下调GR总蛋白的表达(P=0.041)。LPS处理未影响GR对TLR2、4基因启动子的结合，ACTH对此无显著作用。这些结果说明，LPS可能通过激活TLR2基因转录，以及抑制GC以及总GR蛋白的表达，从而引起肺脏发生轻微的炎症反应，在此过程中，LPS并没有影响GR与TLR2启动子的结合。ACTH预处理所模拟的慢性应激对LPS在肺脏的促炎作用无显著影响。
　　3.LPS处理状态下GR对猪肾上腺TLR表达的调控以及慢性应激的影响
　　肾上腺帮助机体维持最佳的生理和免疫功能，它不仅是机体应激系统的终末器官，还具有在急、慢性应激反应时调节机体免疫系统的功能，从而提高宿主对病原入侵的抵抗能力。鉴于肾上腺在机体抵御应激反应中的重要性，本试验继续探讨ACTH处理是否会通过TLRs/GR的交互作用，干扰LPS在肾上腺刺激的炎症反应。本试验的动物处理同上述第二部分试验。LPS单独刺激可使肾上腺细胞线粒体亚结构发生代偿性损伤，ACTH预处理可以明显缓解LPS对线粒体的损伤。无ACTH预处理时，LPS可引起IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、COX-2 mRNA表达的上调（P＜0.05）;ACTH预处理对LPS的诱导效果无显著作用。无ACTH预处理时，LPS有上调IL-6蛋白表达的趋势(P=0.065);有ACTH预处理时，可显著抑制LPS的诱导作用(P＜0.05)，下调IL-6蛋白的表达。无ACTH预处理时，LPS处理2h会极显著上调血清皮质醇水平(P＜0.01);ACTH预处理会显著缓解LPS的作用，使LPS处理6h后肾上腺以及血清中的皮质醇恢复到基础水平。无ACTH预处理时，LPS处理可显著下调T-SOD活性（P＜0.05）;ACTH预处理对LPS的处理效果无显著作用。LPS处理仅对iNOS活性存在主效应，具有显著的上调作用(P=0.048)。LPS处理分别极显著和显著地促进TLR2和TLR4 mRNA的表达（P＜0.01或P＜0.05），但对TLR2、TLR4蛋白的表达却无显著作用;ACTH预处理对LPS的处理效果有显著影响，可显著下调TLR2mRNA的表达（P＜0.05），并有下调TLR4 mRNA表达的趋势(P=0.067)。在无ACTH预处理时，LPS处理会使肾上腺GR mRNA表达显著上调（P＜0.05）;ACTH预处理，对LPS的处理效果无显著作用。LPS极显著降低以TLR4基因为靶的ssc-miR-338表达（P＜0.01），但对ssc-miR-146b表达无显著影响;与对照组相比，ACTH预处理可与LPS共同促进ssc-miR-146b表达上调(P＜0.05)。LPS可显著降低GR对TLR4基因启动子GRE的结合(P＜0.05)。单纯ACTH处理，对炎症因子的释放，皮质醇水平，氧化应激反应，TLR2、TLR4以及GR基因的转录，ssc-miR-146b表达都无显著影响。这说明，LPS可能通过抑制GR与TLR4启动子的结合，从而直接激活TLR4基因的转录，促进肾上腺细胞因子的释放，进而刺激皮质醇的分泌。ACTH预处理后，TLR2、TLR4基因的转录水平下降，一定程度上抑制LPS所诱导的IL-6蛋白的分泌，并促使皮质醇恢复基础水平。

目录

声明

摘要

缩略词

引言

第一章 猪天然免疫及其调控

1 天然免疫

1．1 天然免疫的定义

1．2 天然免疫的组成成分

2 天然免疫的调控

2．1 病原入侵时机体天然免疫应答

2．2 应激对天然免疫的调控

2．3 营养对天然免疫的调控

第二章 TOLL样受体(TLR)研究进展

1 TLR的结构

1．1 TLR基因的结构

1．2 TLR基因的多态现象

2 TLR的功能

2．1 配体的刺激

2．2 TLR表达的分布

2．3 TLR的功能

2．4 TLR的信号通路

3 TLR的调控

3．1 感染对TLR的调控

3．2 应激对TLR的调控

第三章 糖皮质激素受体对天然免疫的调控

1 GR对天然免疫的调控

2 GR调控天然免疫的分子机制

2．1 GR的功能结构

2．2 GR对天然免疫分子的转录调控机制

第四章 猪肺炎支原体感染状态下GR对猪肺脏TLR2的调控以及疫苗免疫影响

1 材料和方法

1．1 猪肺炎支原体和疫苗的准备

1．2 动物处理

1．3 样品采集

1．4 血清皮质醇水平

1．5 TLR、GR基因的表达以及猪肺炎支原体DNA定量

1．6 核蛋白提取

1．7 蛋白免疫印迹(Western Blot)检测肺脏GR和TLR2的表达

1．8 染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation，CHIP)

1．9 统计分析

2 结果与分析

2．1 临床症状、肺损伤以及猪肺炎支原体DNA定量

2．2 血清皮质醇浓度

2．3 肺组织的TLR mRNA和蛋白质表达水平

2．4 肺脏GR mRNA和蛋白水平

2．5 GR与TLR2启动子的结合

3 讨论

第五章 LPS处理状态下GR对猪肺脏TLR表达的调控以及慢性应激的影晌

1 材料和方法

1．1 主要试剂和仪器

1．2 动物处理

1．3 样品采集

1．4 组织匀浆中炎症、氧化应激相关分子含量

1．5 肺组织匀浆皮质醇含量测定

1．6 血清中细胞因子的检测

1．7 基因表达分析

1．8 蛋白表达分析

1．9 microRNA

1．10 ChIP

1．11 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 肺脏炎症和氧化应激相关指标

2．2 血清中细胞因子水平

2．3 TLR2、4 mRNA和TLR2蛋白表达

2．4 GR的mRNA和蛋白表达

2．5 miRNA的表达

2．6 GR与TLR2、TLR4基因启动子的结合

3 讨论

第六章 LPS处理状态下GR对猪肾上腺TLR表达的调控以及慢性应激的影响

1 材料和方法

1．1 主要试剂和仪器

1．2 动物处理

1．3 样品采集

1．4 肾上腺皮质细胞超微结构电镜观察

1．5 组织匀浆中炎症、氧化应激相关指标测定

1．6 组织匀浆中皮质醇含量测定

1．7 基因表达分析

1．8 Western blot分析

1．9 microRNA测定

1．10 ChIP检验

1．11 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 细胞超微结构的变化

2．2 肾上腺炎症、氧化应激相关指标

2．3 正常猪肾上腺TLRs mRNA的表达水平

2．4 肾上腺TLR2、4 mRNA和蛋白表达

2．5 肾上腺GR的mRNA和蛋白表达

2．6 肾上腺miRNA表达

2．7 GR对TLR2、TLR4基因启动子的结合

3 讨论

总体讨论

参考文献

全文结论

本文创新点

致谢

攻读博士学位期间论文发表