黄连素对肉鸡P-gp和CYP3A mRNA表达及其对口服恩诺沙星药动学的影响

摘要

P-糖蛋白是Abcb1基因编码的一种ATP依赖性跨膜转运蛋白。在肿瘤细胞和机体正常组织中均有分布，是造成肿瘤细胞耐药及动物口服药物生物利用度差异的重要原因。CYP3A作为一种重要的Ⅰ相药物代谢酶，临床中60％以上的药物都通过CYP3A代谢，其活性高低是造成药物间相互作用的重要原因。近年来，筛选开发低毒有效的P-gp抑制剂以提高口服药物生物利用度和逆转肿瘤细胞多药耐药已成为研究的热点。中药黄连素(Berberine)主要成分为小檗碱，具有抗菌谱广、绿色天然等优点，是常用的抗感染治疗药物。目前，有研究发现黄连素对大鼠P-gp表达和活性具有一定影响，但黄连素对农场动物家禽P-gp的表达及对口服药物的影响尚未见报道，有待进一步研究。本论文以此为切入点，研究了不同剂量黄连素对内鸡肝脏、肾脏和肠道组织中Abcb1 mRNA表达及对口服恩诺沙的星药动学影响，为兽医临床合理用药以及P-gp抑制剂的筛选提供参考。
　　首先，本实验采用RT-PCR方法探究黄连素不同剂量(40和80 mg/kg)与灌服不同时间（1，3和10天）后对肉鸡Abcb1和CYP3A mRNA表达的影响。比较肉鸡不同组织中Abcb1 mRNA的表达量发现，其在回肠组织中的表达量最高，且黄连素处理后对肝脏、空肠及回肠Abcb1 mRNA表达的影响较为显著。与对照组相比，黄连素处理对肝脏Abcb1 mRNA表达具有一定的诱导作用，其中低剂量的黄连素连续处理3天对肉鸡肝脏的诱导作用显著（P=0.029）;黄连素对肾脏及肠道组织Abcb1 mRNA表达具有不同程度的抑制作用，尤其黄连素处理1天后，对肉鸡十二指肠（P=0.036，P=0.008）、空肠（P=0.086）、回肠（P=0.026，P=0.003）和肾脏（P=0.021，P=0.003）Abcb1 mRNA表达均呈显著抑制作用。黄连素处理后对内鸡肝脏、肾脏CYP3A37mRNA表达影响不显著（P＞0.05）;但经黄连素短时间（1、3天）处理后对十二指肠（P=0.018，P=0.003）、空肠（P=0.032，P=0.012）和回肠（P=0.016，P=0.014）组织中CYP3A37 mRNA表达有明显的抑制作用。对不同处理组肉鸡CXR mRNA检测结果显示:黄连素高、低剂量处理1天后均能显著抑制十二指肠(P=0.039，P=0.031)、空肠（P=0.030，P=0.034）和回肠（P=0.015，P=0.012）组织中CXR mRNA的表达;高、低剂量黄连素处理肉鸡3天后对肝脏CXR mRNA表达水平有一定的诱导作用（P=0.021，P=0.038），CXR mRNA表达变化与Abcb1 mRNA表达变化呈现一定的相关性。
　　其次，为进一步探讨黄连素对Abcb1 mRNA表达的影响，我们以Caco-2细胞为研究对象，测定不同浓度黄连素对Caco-2细胞内Abcb1 mRNA表达的影响。首先采用MTT法测定对Caco-2细胞处理24 h的细胞毒性作用，并根据MTT试验结果选用20和40μM的黄连素处理Caco-2细胞后于不同时间点采集细胞样品检测Abcb1mRNA的表达水平，结果表明:黄连素浓度低于200μM时对细胞的生长率没有影响，当黄连素浓度大于200μM时能够显著抑制细胞的生长。低浓度黄连素处理较短时间（2、4和8h）可显著抑制Abcb1 mRNA的表达，但随处理时间延长至16h以上时，其影响作用不显著;高浓度黄连素对Caco-2细胞Abcb1 mRNA表达的影响与黄连素低浓度时相似，同样在黄连素处理时间较短时能够显著抑制细胞Abcb1 mRNA的表达，处理时间较长时抑制作用不明显。
　　基于黄连素对Abcb1 mRNA表达的影响，本论文进一步探讨了不同剂量的黄连素对肉鸡口服恩诺沙星药动学的影响。结果显示:单剂量口服恩诺沙星后其在肉鸡体内的吸收速率常数(ka)为0.96±0.25，消除半衰期（T1/2ke）为4.19±0.26 h，达峰时间(Tpeak)为2.66±0.45 h，血浆中药物峰浓度（Cmax）为2.28±0.12μg/mL，药时曲线下面积（AUC0-∝及AUC0-2h）分别为21.78±1.59和5.30±0.45(μg/mL)*h;经黄连素高、低剂量处理1天可明显促进恩诺沙星在肉鸡体内的吸收，表现为Ka（1.66±0.17、1.78±0.18,P＜0.05），AUC0-∝(28.04±0.54、29.80±1.68,P＜0.05),AUC0-2h(7.07±0.36、7.60±0.58，P＜0.05)及T1/2ke（5.87±0.48、7.57±1.46，P＜0.05）都显著升高，达峰时间（2.13±0.18、1.78±0.18）虽有所提前，但差异不显著（P＞0.05）。连续灌服黄连素10天后，肉鸡口服恩诺沙星的吸收速率减慢，达峰时间延长，对其他药动学参数影响不显著。结果提示黄连素在低剂量、短时间处理时可影响恩诺沙星在肉鸡体内药动学过程，但高剂量长时间处理对恩诺沙星药动学的影响不明显，其机制仍待进一步研究。

目录

声明

摘要

符号及缩略语

引言

第一章 文献综述

1 P-gp概述

1．1 P-gP的结构及转运机制

1．2 P-gP的生理功能及对药物体内药动学过程的影响

1．3 P-gP抑制剂

1．4 P-gp诱导剂

2 细胞色素氧化酶450研究概述

2．1 CYP3A的生理功能及其催化机制

2．2 CYP3A的诱导剂

2．3 CYP3A的抑制剂

3 黄连素对P-gp和CYP作用的研究进展

3．1 黄连素对P-gp的作用

3．2 黄连素对P-gp影晌的作用机制

3．3 黄连素对CYP作用的研究进展

参考文献

第二章 黄连素对肉鸡肝脏、肾脏及肠组织P-gp和CYP3A37 mRNA表达的影响

1 材料与方法

1．1 试剂

1．2 试验仪器

1．3 实验动物

1．4 方法

1．5 数据分析与统计

2 结果与分析

2．1 RNA完整性及纯度的检测

2．2 RNA及cDNA检测

2．3 realtime PCR动力扩增曲线、产物融解曲线

2．4 黄连素对肉鸡组织Abcb1 mRNA相对表达的影响

2．5 黄连素对肉鸡组织CYP3A mRNA相对表达的影响

2．6 黄连素对肉鸡组织孕烷X受体mRNA相对表达的影响

2．7 Abcb1 mRNA在肉鸡不同组织中的相对表达量

3 讨论

参考文献

第三章 黄连素对Caco-2细胞Abcb1 mRNA表达的影响

1 仪器与材料

1．1 仪器

1．2 材料

2 方法

2．1 Caco-2细胞的培养

2．2 Caco-2细胞增殖试验

2．3 数据分析与统计

3 结果

3．1 黄连素对Caco-2细胞存活率的影响

3．2 黄连素对Caco-2细胞Abcb1 mRNA相对表达的影响

4 讨论

参考文献

第四章 黄连素对肉鸡口服恩诺沙星药动学的影响

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 数据的处理

2 试验结果

2．1 恩诺沙星色谱检测方法的建立

2．2 恩诺沙星的药时曲线与药动学参数

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢