棉蚜化学感受蛋白的基因克隆、动态时空表达及结合特征分析

摘要

昆虫有着极发达的嗅觉系统，藉此识别环境中大量的化学信息并做出相应的生理和行为反应，如逃避天敌，寻找食物源、配偶和产卵场所等。在昆虫嗅觉感受器腔内发现两种可溶性蛋白:气味结合蛋白(odorant-binding proteins，OBPs)和化学感受蛋白(chemosensory proteins，CSPs)。CSPs是一类新的蛋白，可能与昆虫识别外界化学信息有关，但其确切的生理功能仍未知。本文基于棉蚜Aphis gossypii转录组数据，克隆得到了7条编码化学感受蛋白(AgosCSP)的cDNA序列，测定了棉蚜化学感受蛋白的时空表达谱，并利用蛋白体外表达技术及荧光竞争结合实验探讨了AgosCSPs的生理功能。结果如下。
　　1.棉蚜化学感受蛋白的基因克隆及序列分析
　　结合转录组数据分析并利用同源性较高的cDNA序列和RACE技术，克隆了棉蚜7个CSP基因的全长cDNA序列。7个基因分别命名为分别命名为AgosCSP1(GenBank登录号:KC017750)、AgosCSP2(GenBank登录号:KC017751)、AgosCSP3(GenBank登录号:KJ451424)、AosCSP(GenBank登录号:KJ451425)、AgosCSP8(GenBank登录号:KC017753)、AgosCSP13(GenBank登录号:FJ387488)、AgosCSP17(GenBank登录号:KC017754)。序列分析表明，所有CSP均具有典型CSP的序列特征，其中包括4个保守的半胱氨酸位点。
　　2.棉蚜化学感受蛋白动态时空表达分析
　　采用qRT-PCR技术对AgosCSPs在不同时期、不同虫态的棉蚜中mRNA的表达量进行了分析，同时选取秋蚜无翅成虫作为材料研究了AgosCSPs在秋蚜不同组织中的分布情况。试验结果表明AgosCSPs表达分布较广泛，在不同时期不同组织中都有表达，且表达是有差异的。推测其可能执行者各种不同的生理功能。其中AgosCSP1在秋蚜无翅成虫的表达量较高，结合其在足中表达量显著高于其他组织，推测其在寄主定位中有作用;AgosCSP2在越冬寄主木槿树上的棉蚜中相对表达量较其他时期的棉蚜低，在取食棉花的伏蚜和秋蚜中表达量较高，推测该基因与棉蚜对寄主适应性有关。而AgosCSP2在相同时期、寄主相同的棉蚜若虫中相对表达量高于成虫表达量，暗示该基因主要参与棉蚜若虫对寄主的适应过程;AgosCSP3在苗蚜无翅型表达量要显著高于在其他时期，暗示该基因可能涉及对苗蚜无翅成虫和无翅若虫的行为影响。
　　3.棉蚜化学感受蛋白的体外表达及纯化
　　将PCR扩增的AgosCSPs目的产物连接到带有与特异性引物相同酶切位点的表达载体pGEX-4T-1中，构建pGEX-4T-1/AgosCSPs重组表达载体。并选择BL21(DE3)作为表达菌株，通过IPTG诱导进行原核表达。经分析，表达出的蛋白全部为可溶性，经亲和层析、凝血酶处理后纯化出6个高纯度的棉蚜CSP蛋白。
　　4.棉蚜化学感受蛋白与配体结合能力分析
　　利用荧光竞争结合实验的方法测定了棉蚜CSP蛋白对包括棉蚜报警信息素在内的85种化学信息素的结合能力。试验结果表明仅有AgosCSP1与1-氨基蒽和β-紫罗兰酮较强的结合能力，结合常数Ki值分别为2.43μmol·L-1和22.67μmol·L-1，推测其在寄主定位中起一定的作用。而其他蛋白对不同的气味物质有一定的结合能力，但结合能力都很弱，推测部分AgosCSPs承担着除嗅觉作用以外的更为复杂的生理功能，从而调节调节昆虫的生理节奏或者生长发育。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1 棉蚜概述

2 植物挥发物与昆虫行为关系的研究进展

2．1 植物挥发物的种类

2．2 植物挥发物对昆虫的行为的影响

3 昆虫的嗅觉系统和信号传递

4 昆虫化学感受蛋白研究进展

4．1 昆虫化学感受蛋白概述

4．2 昆虫化学感受蛋白的分子结构

4．3 昆虫化学感受蛋白的表达分布

4．4 昆虫化学感受蛋白的生理功能

5 昆虫化学感受蛋白结合实验

6 棉蚜化学感受蛋白研究的目的及意义

第二章 棉蚜化学感受蛋白基因的克隆

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂和溶液

1．3 棉蚜总RNA提取及纯度检测

1．4 反转录合成cDNA第一链

1．6 PCR引物设计

1．7 PCR扩增反应体系

1．8 目的片段的克隆及测序

2 结果与分析

2．1 棉蚜总RNA提取结果

2．2 棉蚜化学感受蛋白基因cDNA片段的获得

2．3 棉蚜化学感受蛋白基因克隆及基本性质分析

2．4 棉蚜化学感受蛋白系统进化分析

2．5 棉蚜化学感受蛋白疏水性分析

2．6 棉蚜化学感受蛋白跨膜区分析

3 讨论

第三章 棉蚜化学感受蛋白动态时空表达分析

1 材料方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试验试剂及设备

1．3 RNA的分离及cDNA的合成

1．4 引物设计

1．5 荧光定量PCR反应

1．6 探针可靠性验证

1．7 数据处理

2 实验结果

2．1 不同时期表达谱分析

2．2 不同组织表达谱分析

3 讨论

第四章 棉蚜化学感受蛋白的表达与纯化

1 材料与方法

1．1 主要试剂与仪器

1．2 常用试剂配方

1．3 质粒提取

1．4 棉蚜化学感受态表达载体的构建

1．5 CSPs的诱导表达

1．6 CSPs重组蛋白的可溶性分析及纯化

1．7 SDS-PAGE分析

2 试验结果

2．1 CSPs载体的构建

2．2 CSPs蛋白诱导表达优化条件

2．3 蛋白大量表达与纯化

3 讨论

第五章 棉蚜化学感受蛋白结合特征分析

1 材料方法

1．1 主要试剂及仪器

1．2 荧光配基与重组蛋白的结合特性

1．3 荧光竞争结合实验

2 实验结果

2．1 荧光配基与重组蛋白的结合特性

2．2 荧光竞争结合实验

3 讨论

全文总结

参考文献

附录：攻读硕士学位期间学术论文的发表情况

致谢