产甘油酵母培养物缓解奶牛热应激的作用及机理研究

摘要

热应激是导致夏季奶牛产奶性能、繁殖性能和免疫力下降的最主要原因之一，尤其在南方夏季气温高、湿度大，而且持续时间长，给奶牛业带来巨大的经济损失。因此，研究奶牛热应激的机理和从营养调控角度探索抗热应激的措施已成为畜牧业的研究热点之一。研究发现日粮中添加酿酒酵母可有效提高热应激奶牛的泌乳量、乳蛋白、非脂固形物和乳糖。另外，国外研究者指出，奶牛在热应激时期对葡萄糖的需求量增加;而且，任何一种能增加丙酸盐（一种主要的生糖前体）产生的饲料补充物，在不降低瘤胃pH的前提下，将有可能提高热应激奶牛的泌乳量。因此，我们推测甘油作为另一种生糖前体，也应该具有提高热应激奶牛泌乳量的作用。鉴于目前养殖业中所应用的甘油主要来于工业生产，易对奶牛的生产性能和身体健康产生不良作用，甚至影响到人类健康，本实验室自行分离酿酒酵母菌，并在高渗条件下发酵生产出一种富含甘油、酵母活菌，以及丰富的氨基酸、维生素等微生物代谢产物的产甘油酵母培养物。本试验就是以这种产甘油酵母培养物添加到奶牛日粮中，研究其对热应激奶牛生理指标、生产性能、血液生化指标、抗氧化能力、激素水平、免疫功能及热休克蛋白和凋亡相关基因的水平调控的影响，探索抗奶牛热应激的新途径。
　　试验1.日粮中添加产甘油酵母培养物对热应激奶牛生理指标和生产性能的影响
　　本试验通过给热应激奶牛补充产甘油酵母培养物来评价其对热应激条件下荷斯坦泌乳奶牛生理指标和生产性能的影响。试验采用完全随机区组设计，试验期为60 d（6月9日至8月8日），在这期间，30头健康荷斯坦奶牛饲喂相同的基础日粮。根据胎次、试验前泌乳量和采食量将这30头奶牛随机分成3个处理组（每组10头）:对照组不添加任何培养物(C)，酵母组每头牛每日添加1L普通酵母培养物（Y，含酵母33.1 g），产甘油酵母组每头牛每日添加2L产甘油酵母培养物(GY，含甘油153.2 g，酵母31.6 g)。所有添加物都于晨饲时拌于基础日粮中单独饲喂。试验期间，每3d连续每1h测定牛棚内的气温和相对湿度，计算温湿度指数(THI)。每周测定全部奶牛的体温和呼吸率，每日测定DMI和泌乳量。每月采集两次乳样，并在试验第0和60 d测定1次奶牛BW和BCS。在本试验中，THI值说明奶牛正处于中度热应激。对照组奶牛在14:00的体温略高于试验组(P＜0.15)，但在其他时间点无明显差别。酵母组和产甘油酵母组奶牛的泌乳量、4％乳脂校正乳(FCM)产量、乳脂量和乳脂率均显著高于对照组(P＜0.05)。产甘油酵母组奶牛的体重下降量与对照组和酵母组相比有降低的趋势（P＜0.15）。添加两种酵母培养物对各组奶牛的呼吸率、DMI和BCS变化均无影响。结果表明日粮中添加产甘油酵母培养物能显著改善热应激奶牛的泌乳性能。
　　试验2.日粮中添加产甘油酵母培养物对热应激奶牛血液生化指标、抗氧化能力和激素水平的影响
　　本试验通过给热应激奶牛补充产甘油酵母培养物来评价其对热应激条件下荷斯坦泌乳奶牛血液生化指标、抗氧化能力和激素水平的影响。试验设计同试验1。于试验第0、15、30、45和60 d在早晨挤奶后、晨饲前采集全部奶牛血样。血浆样品用于测定葡萄糖、尿素氮(UN)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、Na、K离子的浓度、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性等生化指标及超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)等抗氧化指标;红细胞溶解产物用于测定还原型谷胱甘肽(GSH);血清样品用于测定三碘甲腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、皮质醇(Cor)和胰岛素(INS)激素指标。试验结果显示:与对照组相比，酵母组和产甘油酵母组奶牛的总蛋白和白蛋白均有升高（P＜0.05），血浆尿素氮浓度有降低的趋势(P＜0.15)，GSH浓度有升高的趋势(P＜0.15)。与对照组相比，产甘油酵母培养物能显著提高奶牛的血糖水平，降低血浆NEFA浓度(P＜0.05);且产甘油酵母组奶牛的血糖水平比酵母组有升高的趋势（P＜0.15），血浆NEFA水平比酵母组显著降低(P＜0.05)。饲料处理对各组奶牛的其他指标均无影响。
　　试验3.日粮中添加产甘油酵母培养物对热应激奶牛免疫功能的调节作用
　　本试验通过给热应激奶牛补充产甘油酵母培养物来评价其对热应激条件下荷斯坦泌乳奶牛细胞免疫和体液免疫的影响。试验设计同试验1。于试验第0、15、30、45和60 d在早晨挤奶后、晨饲前采集全部奶牛血样。血清样品用于检测IL-2、IFN-γ、TNF-α和IgG水平。抗凝血用于分离、培养淋巴细胞检测淋巴细胞转化率。结果显示:与对照组相比，普通酵母培养物和产甘油酵母培养物明显促进ConA介导的T细胞转化（P＜0.05），刺激指数显著高于对照组(P＜0.05)。酵母组和产甘油酵母组奶牛在第30和45 d的淋巴细胞IL-2水平显著高于对照组（P＜0.05）。在60 d时，酵母组和产甘油酵母组奶牛的血清IL-2水平比对照组有增加的趋势(P＜0.15)。普通酵母培养物和产甘油酵母培养物均能提高45 d的IgG水平，其中产甘油酵母组与对照组相比差异显著(P＜0.05)，与酵母组相比有增加的趋势(P＜0.15)。饲料处理对各组奶牛的IFN-γ和TNF-α水平无影响。
　　试验4.日粮中添加产甘油酵母培养物对热应激奶牛外周血淋巴细胞热休克和凋亡相关基因表达水平的影响
　　本试验通过给热应激奶牛补充产甘油酵母培养物来评价其对热应激条件下荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞热休克蛋白和凋亡相关基因表达水平的影响。试验设计同前。于试验第0、15、30、45和60 d在早晨挤奶后、晨饲前采集全部奶牛血样。采用real-time PCR分析外周血淋巴细胞中HSP70、HSF1、Bcl-2和Bax-α mRNA的相对表达水平。结果显示:与对照组相比，普通酵母培养物和产甘油酵母培养物均能下调热应激奶牛在第30、45和60 d时的HSP70 mRNA表达水平（P＜0.05），降低第45扣60 d时的HSF1 mRNA表达水平及第45 d时的Bax-α mRNA表达水平(P＜0.05)。产甘油酵母组奶牛在第30 d时的Bax-α mRNA表达水平显著低于对照组（P＜0.05），第45 d时的HSP70 mRNA表达水平显著低于酵母组(P＜0.05)。另外，从整体表达水平来看，添加普通酵母培养物和产甘油酵母培养物均能显著降低奶牛外周血淋巴细胞中HSP70、HSF1和Bax-α mRNA的表达水平（P＜0.05），提高Bcl-2/Bax-α表达量比值（P＜0.05）;并且产甘油酵母组奶牛的HSP70 mRNA相对表达水平显著低于酵母组(P＜0.05)，HSF1和Bax-α mRNA的相对表达水平比酵母组有降低的趋势（P＜0.15），Bcl-2/Bax-α mRNA表达量之比相对于酵母组有升高的趋势(P＜0.15)。说明普通酵母培养物和产甘油酵母培养物使奶牛对热应激的易感性降低，耐热性增强，并且产甘油酵母培养物效果更好。
　　试验5.不同浓度酵母多糖对奶牛外周血淋巴细胞体外热应激的调节作用
　　从非热应激奶牛外周血分离淋巴细胞，分别用0（对照）、10、30、60和90μg/L的酵母多糖（zymosan）孵育，以37℃或45℃水浴培养作为非热应激组和热应激组(P＜0.05)，并使用PHA刺激或不加刺激培养。结果显示，与非热应激组相比，热应激组淋巴细胞的增值率、还原型GSH浓度、SOD活性、IL-2水平和Bcl-2/Bax-αmRNA表达量之比均显著降低，MDA浓度和HSP70 mRNA表达水平显著上升(P＜0.05)。与对照组相比，酵母多糖能显著提高热应激组淋巴细胞的SOD活性和Bcl-2/Bax-α mRNA表达量之比(P＜0.05)，降低MDA浓度和HSP70 mRNA的表达;酵母多糖能显著促进热应激和非热应激组PHA介导的淋巴细胞的增殖和IL-2的产生(P＜0.05)。这些结果表明酵母多糖改善了PHA刺激的淋巴细胞的氧化还原状态，降低热应激引起的氧化损伤，进而调节凋亡相关基因的表达，增加了淋巴细胞对热应激条件的适应能力。

目录

论文说明

声明

摘要

符号和缩略语

前言

第一章 奶牛热应激的研究进展

1 应激的定义

2 热应激概述

2．1 奶牛热应激的发生

2．2 热应激的评定标准

3 热应激对奶牛的影响

3．1 对呼吸率的影响

3．2 对直肠温度的影响

3．3 对干物质采食量(DMI)的影响

3．4 对消化率的影响

3．5 对泌乳性能和乳品质的影响

3．6 对血液生化指标的影响

3．7 对内分泌和免疫功能的影响

3．8 对繁殖性能的影响

4 奶牛热应激的综合防治措施

4．1 物理措施

4．2 遗传选择

4．3 营养调控措施

4．4 抗热应激添加剂的应用

参考文献

第二章 益生菌概述

1 益生菌的发展史

2 益生菌的种类

3 益生菌的特性

4 益生菌的生物学功能

4．1 益生茵的营养作用

4．2 维持消化道菌群平衡

4．3 免疫调节作用

4．4 其他作用

5 益生菌的作用机理

5．1 优势种群理论

5．2 生物夺氧理论

5．3 生物拮抗理论

5．4 微生物群与营养关系理论

5．5 三流循环学说

6 益生菌在畜牧养殖业中的应用

6．1 应用于禽类饲料

6．2 应用于猪饲料

6．3 应用于奶牛饲料

参考文献

第三章 甘油的研究进展

1 甘油的生产方法概述

1．1 皂化法

1．2 油脂水解法

1．3 丙烯氯化法

1．4 丙烯过乙酸氧化法

1．5 微生物发酵法

2 耐高渗透压酵母的甘油代谢

2．1 甘油的合成代谢

2．2 甘油的分解代谢

3 甘油在动物饲料中的研究应用

4 甘油与奶牛

4．1 甘油在奶牛体内的代谢

4．2 甘油对奶牛的影响

参考文献

第四章 日粮中添加产甘油酵母培养物对热应激奶牛生理指标和生产性能的影响

1 材料与方法

1．1 主要试剂

1．2 器材

1．3 普通酵母培养物和产甘油酵母培养物

1．4 实验动物及饲养管理

1．5 试验设计

1．6 采样与样品测定

1．7 统计

2 结果与分析

2．1 试验牛舍环境温湿度指数的变化

2．2 热应激奶牛的直肠温度和呼吸频率

2．3 热应激奶牛的采食量、体重和体况评分的变化

2．4 热应激奶牛的泌乳性能

3 讨论

3．1 THI与奶牛热应激

3．2 产甘油酵母培养物对热应激奶牛直肠温度和呼吸频率的影响

3．3 产甘油酵母培养物对热应激奶牛采食量、体重和体况评分的影响

3．4 产甘油酵母培养物对热应激奶牛泌乳性能的影响

参考文献

第五章 日粮中添加产甘油酵母培养物对热应激奶牛外周血生化指标、抗氧化能力及激素水平的影响

1 材料与方法

1．1 主要试剂

1．2 器材

1．3 普通酵母培养物和产甘油酵母培养物

1．4 试验动物及饲养管理

1．5 试验设计

1．6 样品的采集与制备

1．7 测定指标及方法

1．8 统计

2 结果与分析

2．1 热应激奶牛的血浆代谢产物

2．2 热应激奶牛的抗氧化能力

2．3 热应激奶牛的激素水平

3 讨论

3．1 产甘油酵母培养物对热应激奶牛血浆代谢产物的影响

3．2 产甘油酵母培养物对热应激奶牛抗氧化能力的影响

3．3 产甘油酵母培养物对热应激奶牛激素水平的影响

参考文献

第六章 日粮中添加产甘油酵母培养物对热应激奶牛免疫功能的调节作用

1 材料与方法

1．1 主要试剂

1．2 器材

1．3 普通酵母培养物和产甘油酵母培养物

1．4 试验动物及饲养管理

1．5 试验设计

1．6 样品的采集与处理

1．7 测定指标及方法

1．8 统计

2 结果与分析

2．1 热应激奶牛外周血T淋巴细胞的转化

2．2 热应激奶牛血清中IL-2水平的变化

2．3 热应激奶牛血清IFN-γ水平的变化

2．4 热应激奶牛血清中TNF-α水平的变化

2．5 热应激奶牛血清中IgG水平的变化

3 讨论

3．1 产甘油酵母培养物对热应激奶牛细胞免疫功能的影响

3．2 产甘油酵母培养物对热应激奶牛血清细胞因子水平的影响

3．3 产甘油酵母培养物对热应激奶牛体液免疫功能的影响

参考文献

第七章 日粮中添加产甘油酵母培养物对热应激奶牛外周血淋巴细胞热休克和凋亡相关基因表达水平的影响

1 材料与方法

1．1 主要试剂

1．2 器材

1．3 普通酵母培养物和产甘油酵母培养物

1．4 试验动物及饲养管理

1．5 试验设计

1．6 样品的采集与处理

1．7 统计

2 结果与分析

2．1 淋巴细胞总RNA的提取

2．2 目的基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果

2．3 热应激奶牛外周血淋巴细胞HSP70 mRNA的相对表达水平

2．4 热应激奶牛外周血淋巴细胞HSF1 mRNA的相对表达水平

2．5 热应激奶牛外周血淋巴细胞Bax-α mRNA的相对表达水平

2．6 热应激奶牛外周血淋巴细胞Bcl-2 mRNA的相对表达水平

2．7 热应激奶牛外周血淋巴细胞热休克和凋亡相关基因的整体表达水平

3 讨论

3．1 产甘油酵母培养物对热应激奶牛外周血淋巴细胞热休克相关基因表达的影响

3．2 产甘油酵母培养物对热应激奶牛外周血淋巴细胞凋亡相关基因表达的影响

参考文献

第八章 酵母多糖对奶牛外周血淋巴细胞体外热应激的免疫调节作用

1 材料与方法

1．1 主要试剂

1．2 器材

1．3 试验动物

1．4 淋巴细胞的处理

1．5 统计

2 结果与分析

2．1 不同浓度酵母多糖对奶牛外周血淋巴细胞的毒性作用

2．2 酵母多糖对体外热应激淋巴细胞增殖的影响

2．3 酵母多糖对体外热应激淋巴细胞内还原型GSH浓度的影响

2．4 酵母多糖对体外热应激淋巴细胞内SOD活性的影响

2．5 酵母多糖对体外热应激淋巴细胞内MDA浓度的影响

2．6 酵母多糖对体外热应激淋巴细胞IL-2产量的影响

2．7 酵母多糖对体外热应激淋巴细胞HSP70 mRNA表达的影响

2．8 酵母多糖对体外热应激淋巴细胞Bcl-2／Bax-α mRNA表达之比的影响

3 讨论

参考文献

全文总结

论文的创新点

攻读博士学位期间发表论文

致谢