棉铃虫田间种群氰戊菊酯抗性的机理及新药剂抗性风险评估

摘要

棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)为鳞翅目夜蛾科的一种多食性农业害虫，在世界范围内广泛分布，对棉花危害严重，防治不当会给棉花生产造成重大的经济损失。目前，棉铃虫已对有机氯、有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯等多种杀虫剂产生了不同程度的抗药性。自1997年我国开始大面积推广种植转基因Bt抗虫棉花（简称Bt棉），有效抑制了棉铃虫的种群数量，减少化学杀虫剂使用的同时也控制了它的危害。但随之而来的转基因Bt棉的非靶标害虫（如盲蝽等）在棉田为害加重，加上棉花生长后期Bt毒素蛋白表达量的下降导致其对棉铃虫的防治效果降低，目前在棉田化学防治仍是控制害虫为害的一种非常重要的手段。2011年本研究室抗性监测结果表明，华北棉区棉铃虫对氰戊菊酯的抗性已超过Bt棉种植前的水平。本文报告了2013年全国多个省份棉花种植区田间棉铃虫对氰戊菊酯、辛硫磷和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（甲维盐）抗性监测的结果，同时通过生物测定、生物化学检测和分子生物学检测对不同的田间棉铃虫种群氰戊菊酯抗性的机理进行了检测，为棉铃虫抗药性的快速检测尝试了多种可行的方法。同时调查了田间棉铃虫对甲维盐、多杀菌素、溴虫腈和氯虫苯甲酰胺等4种新型药剂的敏感性并建立了敏感毒力基线，为今后的抗性风险评估提供了基础数据;还开展了棉铃虫对甲维盐抗性的室内筛选工作，为棉铃虫甲维盐抗性的监测和预警提供科学依据。
　　1.棉铃虫田间种群抗性监测及氰戊菊酯抗性的机理
　　采用点滴法监测了2013年夏季7个省份的18个棉铃虫田间种群对氰戊菊酯和辛硫磷的抗性情况，所有田间种群对氰戊菊酯均表现为极高抗性水平（256-1806倍），对辛硫磷具有中低水平抗性或敏感性下降（1-12倍）。对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（甲维盐）的敏感性调查表明，18个田间种群对甲维盐的LD50值波动幅度为6倍（0.367-2.235 ng/头），大多数低于室内敏感品系SCD的LD50（1.028 ng/头）。
　　通过生物测定、生物化学检测和分子生物学方法对不同田间棉铃虫种群氰戊菊酯抗性的机理进行了研究。
　　对来自7个省的7个田间种群进行的氰戊菊酯活体增效试验表明，在氰戊菊酯区分剂量(DD)处理下，七个田间种群的存活率为96-100％;在氰戊菊酯区分剂量+DEF（酯酶抑制剂）处理下，存活率仅下降了6-15％;而在氰戊菊酯区分剂量+PBO（氧化酶抑制剂）处理情况下，存活率下降了68-94％;说明多功能氧化酶引起的解毒代谢增强可能是棉铃虫田间种群氰戊菊酯抗性的主要机理，酯酶解毒增强可能也参与了抗性的形成，但作用不明显。
　　对7个田间种群进行了解毒代谢酶活力的测定。与敏感品系SCD相比，七个田间种群的细胞色素P450氧化酶活力显著升高，且对3个不同的底物（对硝基苯甲醚、乙氧基香豆素和甲氧基异酚恶唑）的活力差异（即PNOD、ECOD和MROD）在大多数种群内表现为极显著。七个田间种群MROD酶活力分别是SCD的16、9、7、7、4、4和3倍，这种差异与对氰戊菊酯的抗性具有相关性。而酯酶在7个田间种群中酶活力比敏感品系要低。解毒代谢酶活力测定的结果与活体增效的试验结果相吻合。
　　在澳大利亚棉铃虫抗性种群中发现，细胞色素P450氧化酶基因CYP337B1和CYP337B2通过基因融合产生的新基因CYP337B3可以增强了对氰戊菊酯的解毒代谢功能，使棉铃虫对氰戊菊酯产生42倍的抗性。为了明确中国的田间种群中CYP337B3是否也与抗性相关，我们检测了11个棉铃虫田间种群和2个对照种群中CYP337B3纯合个体的频率。从空间即不同田间种群的情况分析，7个2013田间种群CYP337B3纯合个体的频率极高(92-100％)，而在敏感品系SCD中不存在该突变基因。从来源于不同采集时间的种群分析，新疆沙湾SW种群从2008年到2013年CYP337B3纯合个体频率随着抗性倍数的升高而升高(71-96％)。但SW2008种群对氰戊菊酯没有抗性，其CYP337B3纯合个体频率为71％; SW2011种群对氰戊菊酯仅有10倍抗性，其CYP337B3纯合个体频率达79％。因此根据上述结果推断，尽管CYP337B3纯合个体频率很高，但中国棉铃虫对氰戊菊酯的抗性应该还与其它一些P450基因有关。
　　2.棉铃虫对新型杀虫剂的抗性风险评估
　　对新药剂进行田间的敏感性调查和建立敏感毒力基线是开展抗性风险评估工作的基础。利用浸叶法调查了2012年的10个田间种群和3个室内品系对甲维盐、多杀菌素、溴虫腈和氯虫苯甲酰胺的敏感性。对于这4种药剂，2个Cry1Ac活化毒素高抗品系和1个室内敏感品系均表现出很高的敏感性，且品系间差异不大。田间种群对溴虫腈的LC50值为0.206-10.588mg/L之间，敏感性波动幅度高达52倍。田间种群对甲维盐的LC50值介于0.182-3.406μg/L之间，波动幅度为19倍。对于多杀菌素，田间种群的LC50值介于1.728-9.011 mg/L;对于氯虫苯甲酰胺，田间种群的LC50值介于0.338-1.739 mg/L，两者的波动幅度均在6倍之内。棉铃虫田间种群对不同药剂的敏感性变异幅度可能与田间用药差异或不同遗传背景导致的内禀敏感性差异有关。
　　为了进一步评估棉铃虫对甲维盐的抗性风险，在室内进行了抗性选育和现实遗传力的估算。采用点滴法对棉铃虫室内敏感品系SCD用甲维盐连续汰选10代，抗性上升了5.5倍。采用阈性状分析方法，计算出棉铃虫对甲维盐的抗性现实遗传力（h2）为0.104。再进一步预测其抗性发展速度，假设以90％死亡率的剂量继代处理棉铃虫，其抗性倍数达到10倍需要9代，因此棉铃虫对甲维盐存在着一定程度的抗性风险。这一结论提醒我们，在甲维盐的大规模实际应用前，应提前做好预防性抗性治理方案的制定。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 棉铃虫的发生与为害

2 棉铃虫抗药性现状

2．1 棉铃虫对有机氯类杀虫剂抗药性概况

2．2 棉铃虫对有机磷类杀虫剂抗药性概况

2．3 棉铃虫对氨基甲酸酯类杀虫剂抗药性概况

2．4 棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性概况

2．5 新型药剂对棉铃虫的防治效果

3 棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性机理

3．1 表皮穿透速率降低

3．2 解毒代谢作用增强

3．3 靶标敏感性降低

3．4 多因子互作的拟除虫菊酯抗性机制

4 抗性监测及治理策略

4．1 昆虫抗药性监测

4．2 新型药剂的风险评估

4．3 抗性治理策略

5 本文研究的目的和意义

第二章 材料与方法

1 供试昆虫

2 供试试剂

2．1 供试药剂

2．2 生化试剂

2．3 分子生物学试剂

3 仪器设备

4 主要试验方法

4．1 生物测定方法

4．2 增效剂的增效作用试验

4．3 解毒代谢酶酶活力测定

4．4 棉铃虫基因组DNA的制备

4．5 P450 CYP33783基因的鉴定

4．6 抗性风险评估

5 数据分析

5．1 生物测定结果数据分析

5．2 酶活力测定结果数据分析

第三章 结果与分析

1 棉铃虫田间种群氰戊菊酯抗性的机理

1．1 棉铃虫田间种群抗药性监测

1．2 棉铃虫田章种群氰戊菊酯抗性的机理

2 棉铃虫对新型杀虫剂的抗性风险评估

2．1 棉铃虫田间种群对4种新型杀虫剂的敏感性变异

2．2 棉铃虫对甲维盐的抗性风险评估

第四章 讨论

1 棉铃虫田间种群氰戊菊酯抗性的机理

1．1 棉铃虫田间种群的抗药性监测

1．2 棉铃虫田间种群氰戊菊酯抗性的机理

2 棉铃虫对新型杀虫剂的抗性风险评估

2．1 棉铃虫地理种群对4种新型杀虫剂的敏感性变异

2．2 棉铃虫对甲维盐的抗性风险评估

全文总结

参考文献

附录

致谢