灰飞虱谷氨酸门控氯离子通道(LsGluCls)的表达模式和药理学特性研究

摘要

谷氨酸门控氯离子通道(GluCls)是半胱氨酸环配体门控离子通道超家族(cys-loopLGIC superfamily)中的一类，对控制吞咽、运动、感知和保幼激素的生物合成等可能起关键作用。由于GluCls只存在于无脊椎动物体内，因此是很多高选择性药剂的作用靶标。本论文以灰飞虱作为供试昆虫，研究了GluCls的分子生物学和药理学特征，包括基因序列分析、剪接体表达模式分析和功能验证等。我们所发现的LsGluCl基因的新的剪接体丰富了昆虫GluCls的多样性，并进一步探索了其分子生物学和药理特征，本研究可为对以此为作用靶标的新药剂开发提供理论基础。
　　1、灰飞虱GIuCl基因序列分析
　　采用巢式PCR技术分别克隆了氟虫腈敏感和抗性2个品系及1个田间种群灰飞虱的GluCl基因，对三个品系（种群）的GluCl基因进行了多态性分析。结果发现了80个核苷酸多态性(SNPs)，共导致了20个氨基酸变化;进一步重点分析这20个氨基酸变化在三个品系（种群）中的差异，试图从多态性方面讨论GluCl基因与药剂使用和抗性水平的关系。结果显示灰飞虱GluCl基因存在大量的多态性位点，遗传背景相同的室内敏感和氟虫腈抗性品系存在7个氨基酸差异(V68I、I73L、S79A、K80T、D82S、V84I、K85T)，遗传背景不同的田间种群与室内敏感品系也有6个氨基酸的差异(D63A、P66H、A67T、C226Y、P259L、R352C)，且多态性位点大部分位于亲水的N端胞外区，但由于替换频率低，无法说明灰飞虱对氟虫腈的抗性是因为GluCl基因发生氨基酸突变引起的。
　　通过基因克隆测序发现灰飞虱GluCl转录本存在两个剪接位点、两种剪接模式。第一个剪接位点位于LSGluCl的N端，即保守的exon3，在昆虫基因组中存在外显子exon3a，exon3b和exon3c，通过互斥外显子的剪接形式形成了不同剪接体LsGluCl-A、LsGluCl-B和LsGluCl-C;第二个剪接位点是在第三和第四跨膜区之间的胞内区域，附加了一段编码SDDVLFQ的短肽，出现了另一种剪接形式即可变的3'端，形成了两种不同的GluCl蛋白，即LsGluCL-L和LsGluCl-S。
　　2、灰飞虱GluCl剪接体表达模式
　　根据不同剪接体的不同碱基序列设计引物，通过荧光定量PCR技术，得到不同剪接体在灰飞虱不同发育阶段及成虫不同组织的表达差异。定量结果显示，首先，第一个剪接位点所形成的三种剪接体在灰飞虱不同发育阶段，LsGluCl-A剪接体一直高水平表达，LsGluCl-B在各个阶段表达水平低于A高于C，且表达水平在不同阶段无明显变化，而LsGluCl-C则随着虫龄增大表达水平随之上升，在4龄后与B的表达水平达到一致;其次，另一个剪接位点形成的剪接体LsGluCl-L在灰飞虱4龄之前是LsGluCl基因的主要存在形式，而在5龄和雌成虫期，LsGluCl-S剪接体表达量显著增多。GluCls主要存在于昆虫的中枢神经系统和肌肉神经中，所以在头部和腿部表达量较高，本论文所得到的结果也显示所有剪接体都在成虫头部表达量最高，其中LsGluCl-A的表达水平显著高于B和C;LsGluCl-S和LsGluCl-L的表达水平基本一致。在抗、感品系LsGluCl不同剪接体表达差异中显示，氟虫腈抗性品系中，只有LsGluCl-A剪接体表达水平明显下降(p＜0.05），而其他剪接体则没有明显变化(p＞0.05)，结果最终导致总型LsGluCl在氟虫腈抗性品系中表达量下降。
　　3、灰飞虱GluCls电药理学特性研究
　　在无脊椎动物的神经系统中，抑制性谷氨酸受体（IGluR）与离子通道偶联，对神经递质谷氨酸起快速反应，从而达到抑制作用。本论文从灰飞虱体内克隆得到了GluClα亚基，采用体外转录、cRNA注射、爪蟾卵母细胞表达和双电极电压钳记录来研究其功能。对照结果显示L-谷氨酸(浓度为1μM)对未注射LsGluCl的cRNA的卵母细胞（同体积的超纯水）不能诱发出可见电流，而记录的50例注射cRNA的细胞中，持续灌流谷氨酸(1μM)，可在95％的细胞上诱发出内向电流。不同浓度的谷氨酸灌流所诱发的电流幅度随谷氨酸浓度的升高而增大，利用origine8.0软件对谷氨酸诱发电流的量效关系曲线进行拟合，拟合结果显示:EC50=18.69±3.5μM。
　　在20μM谷氨酸灌流的基础之上，测定拮抗剂氟虫腈和PTX对GluCls的抑制作用。其对爪蟾卵母细胞表达的LsGluCls通道电流的抑制作用，均具有浓度依赖特性，IC50值分别为396±96nM、67.5±18.5μM，可见氟虫腈对GluCls的抑制效率显著高于PTX。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 谷氨酸受体研究进展

1．1 半胱氨酸环配体门控离子通道超家族(cys-loop LGIC)

1．2 谷氨酸门控氯离子通道

2 作用于谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)的杀虫剂

2．1 阿维菌素／美倍霉素类药剂

2．2 氟虫腈

3 昆虫谷氨酸门控氯离子通道作为杀虫剂作用靶标的研究前景

第二章 灰飞虱GluCl基因序列分析

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂与仪器

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 不同种群和品系灰飞虱对氟虫腈的敏感(抗)性测定

2．2 多态性位点的发现

2．2 剪接体的发现

3 讨论

第三章 灰飞虱GluCl基因剪接体表达模式

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂与仪器

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 PCR产物溶解曲线分析

2．2 不同剪接体时空表达差异

2．3 氟虫腈抗、感品系LsGluCl剪接体的表达量差异

3 讨论

第四章 灰飞虱GluCl基因电生理功能

1 材料

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂

1．3 实验动物

1．4 仪器及记录系统

2 方法

2．1 溶液配制方法

2．2 cRNA合成

2．3 爪蟾卵母细胞的获取

2．4 注射针制备

2．5 cRNA注射

2．6 记录电极制备

2．7 TEVC记录

3 结果与分析

3．1 谷氨酸诱发电流

3．2 谷氨酸诱发电流的浓度依赖性

3．3 氟虫腈对LsGluCls通道电流的抑制作用

3．4 木防己苦毒素(PTX)对LsGluCls通道电流的抑制作用

4 讨论

全文总结

参考文献

附录

致谢