菊花CmMYB59转录因子的克隆和功能验证

摘要

菊花为我国十大名花，因其花色艳丽、花型多样，深受人们喜爱，具有很大观赏价值和经济价值。MYB转录因子是植物中数量和功能最多样的的转录因子之一，在植物伸长发育过程中起着重要作用。本研究克隆了一个菊花CmMYB59转录因子，并对其表达特性、亚细胞定位及转录激活活性等进行了研究，通过转基因手段，研究其对根伸长的影响，同时为菊花种质创新提供新的种质资源。主要研究结果如下:
　　1.以菊花品种‘神马’为实验材料，利用RT-PCR与RACE等技术克隆得到一个MYB转录因子的cDNA全长序列，并发现了其一种可变剪切。该基因全长904bp，开放阅读框为768bp，编码255个氨基酸，蛋白质分子量61.99KD，等电点:4.99 kD。同源性分析表明，此基因为典型的R2R3型MYB转录因子，与拟南芥的AtMYB59同源性较高，具有保守的R2R3结构域和调控基序YNSMDEIW，因此命名为CmMYB59（GenBank登录号:KR052024）。系统进化树分析表明CmM YB9与丹参、玉米的亲缘关系较近，与其他物种较远。
　　2.通过荧光定量分析了‘神马’CmMYB59的组织、非生物胁迫和开花期的表达特性。结果表明:CmMYB59在根中表达最高，茎、叶中次之，茎尖和花器官中最低;随着花芽分化进程，叶中CmMYB59表达量逐渐升高，在小花原基分化末期达到顶峰，随后降低;低温胁迫会诱导CmMYB9的表达，而高温胁迫、盐胁迫、ABA处理后，CmMYB59的表达量均表现出2h内短暂下降随后迅速升高的趋势。由此可知，CmMYB59可能参与菊花花芽分化的过程，并且参与了菊花多种胁迫过程，包括低温、高温、盐胁迫等，而响应时间和表达幅度的差异则说明CmMYB59对其调控机制不同。构建绿色荧光蛋白融合表达载体pMDC43-GFP-CmMYB59，并将其转入洋葱表皮细胞。亚细胞定位分析显示，CmMYB9蛋白定位于细胞核上。构建酵母表达载体pDEST-GBKT7-CmMYB59，通过酵母单杂交的方法验证其转录激活活性，结果表明，CmMYB9具有转录激活活性。
　　3.构建超表达载体pMDC43-CmMYB59，将CmMYB59分别转入拟南芥和菊花品种‘神马’中，通过潮霉素抗性筛选及RT-PCR鉴定，分别获得超表达的菊花转基因株系Z2、Z6和拟南芥转基因株系L1、L3。对转基因拟南芥株系L1、L3和野生型WT拟南芥进行花期观察和主根长测量，花期观察结果为超表达株系与野生型花期一致，无明显差异，表明CmMYB9对花期无直接影响;根伸长结果表明，超表达转基因株系的根长小于WT的根长。拟南芥细胞周期相关基因ARR16、NAM-LIKE、CYB:1;1基因的qRT-PCR表明，相比于野生型WT株系，超表达株系的NAM-LIKE基因和CYB1;1基因的表达量明显上升，而ARR16基因则与WT相差不大，说明CmMYB59可能通过细胞分裂而对根的伸长产生抑制作用。

目录

声明

摘要

缩略词

引言

第一章 文献综述

1 MYB转录因子的研究进展

1．1 MYB转录因子的结构

1．2 MYB的进化

1．3 MYB转录因子的表达模式

1．4 MYB转录因子的功能

2 细胞周期的研究进展

2．1 细胞分裂相关基因的发现与功能

3 根发育的研究进展

3．1 植物根的分类和结构

3．2 植物根系的发育过程

3．3 植物激素对根发育的影响

3．4 影响根发育的细胞周期因子

4 本研究的目的及意义

第二章 菊花CmMYB59转录因子的克隆与序列分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 试剂与仪器

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 RNA提取质量与反转录效果检测

2．2 CmMYB59基因的克隆

2．3 CmMYB59的生物信息学分析

3 讨论

第三章 菊花CmMYB59基因的表达特性分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 试剂与仪器

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 CmMYB59荧光定量表达特性

2．2 亚细胞定位分析

2．3 CmMYB59转录激活活性分析

3 讨论

第四章 菊花CmMYB59基因对拟南芥和菊花的遗传转化研究

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 试剂与仪器

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 转基因菊花的获得与检测

2．2 转基因拟南芥的获得与检测

2．3 CmMYB59转录因子功能分析

3 讨论

全文结论

创新点

参考文献

附录

发表论文及所获奖励

致谢