基于微卫星和线粒体DNA分子标记的截形叶螨种群遗传结构研究

摘要

截形叶螨Tetranychus truncatus(Ehara)属于蛛形纲Arachnida、蜱螨亚纲Acari、真螨目Acariformes、叶螨科Tetranychidae，是一种多食性的重要害螨，是东亚和东南亚地区的主要农作物和经济作物害虫之一。和绝大多数叶螨属螨类类似，截形叶螨主要通过刺吸式口器取食危害寄主。当取食时，其口针刺入叶片组织，取食栅栏层细胞的叶绿粒和细胞液而对植物造成危害。棉苗等作物受害时整个叶片变黄发皱直至干枯脱落。截形叶螨的近似种二斑叶螨是叶螨属中被研究最多的害螨，其基因组也于2011年底发表。而实验室近五年采样调查发现，中国主要棉区、玉米产区等地截形叶螨有替代二斑叶螨成为主要害螨的趋势。然而，由于遗传标记的缺乏，中国截形叶螨的种群遗传结构及种群遗传多样性尚未进行系统的研究。
　　Wolbachia是一种胞内共生菌，其广泛存在于节肢动物体内，同线粒体一样也是母系遗传。Wolbachia通过诱导产生胞质不亲和(CI)、雌性化(feminization)、孤雌生殖(parthenogenesis)和杀雄作用(male-killing)四种方式调控寄主的生殖行为，以实现其在寄主种群中的稳定存在和扩散。由于Wolbachia对于寄主的生殖调控和复杂的生物学影响，很多学者研究认为Wolbachia能够影响宿主种群遗传结构及遗传多样性，甚至能产生生殖隔离促进物种形成。Wolbachia在叶螨体内存在的报道已经不少，但其对于叶螨种群分化及遗传结构的影响尚不清楚。
　　基于以上原因，本研究主要利用微卫星和线粒体COI分子标记来研究截形叶螨的遗传多样性，遗传结构，遗传分化与地理距离、温度和内共生菌Wolbachia之间的联系。由于本实验之前可应用的截形叶螨微卫星位点较少，本研究首先利用形态与分子相结合的方法区分截形叶螨与二斑叶螨、豆叶螨、卢氏叶螨、皮氏叶螨等易混淆种，准确鉴定截形叶螨，接着利用微卫星的转移特性，从二斑叶螨基因组中通过生物信息学方法筛选微卫星并转移到截形叶螨中试验，开发截形叶螨的微卫星标记。接着研究出一种高效稳定的分型方法用于高通量微卫星分型，并在神泽叶螨、花蓟马、褐飞虱中验证分型方法的可靠性和通用性。最后利用上述开发的微卫星及其高通量分型方法外加线粒体COI分子标记来研究截形叶螨的遗传多样性，遗传分化，种群遗传结构等。
　　之前有学者研究表明，GenBank中至少30％的叶螨序列鉴定错误，使得单纯依靠分子测序鉴定叶螨并不可靠。同时，叶螨属截形叶螨同二斑叶螨红色型、豆叶螨、卢氏叶螨等形态十分相似，形态学鉴定需要很扎实的功底且不适合于种群研究中高通量的叶螨鉴定。本研究使用形态与分子相结合的方法，形态学上以雄螨阳具为依据，分子鉴定依据核糖体转录间隔区(ITS)限制性内切酶片段长度多态性技术(RFLP)图谱鉴定。两者结合准确鉴定截形叶螨等常见的叶螨种，为后续针对截形叶螨的研究打下坚实基础。通过本方法还有效鉴定了二斑叶螨，其基因组是微卫星转移法开发的重要资源。鉴定出的神泽叶螨则为验证高通量微卫星分型方法提供了材料。
　　由于传统开发微卫星标记的方法成本昂贵且耗时，导致大部分非模式生物微卫星位点极少甚至无位点可用。微卫星标记的缺乏大大阻碍了对截形叶螨种群遗传结构及相关研究的开展。早先的研究表明，叶螨属内种间存在较高的微卫星转移性。进而在本研究中，我们通过生物信息学的方法，从截形叶螨的近似种二斑叶螨的基因组序列中筛选出205个候选微卫星位点，并进行PCR扩增引物设计和位点测试。结果显示近一半的(102个)引物对扩增获得了所需的PCR产物，最后成功获得36个有多态性的位点。36个位点中，每个位点包含2-23个不等的等位基因数，多态信息含量PIC(polymorphism information content)为0.589（介于0.119-0.922之间）。用所获得的36个位点对三个截形叶螨种群进行实验，表观杂合度范围为0.063-0.844，预期杂合度的范围为0.061-0.903。通过所有种群和位点计算的总体Fst值为0.098(P＜0.001)，表明种群间存在中等且显著的遗传分化。继续将获得的微卫星位点转移，在36个微卫星位点中，有22个位点在皮氏叶螨T.piercei上适用，但只有小部分位点能在卢氏叶螨T.ludeni和豆叶螨T.phaselus上适用。利用转移性对微卫星标记的开发颇具成本效益，对促进种群遗传研究有极大的意义。
　　由于本研究所用虫体样本数和微卫星位点数都较高，使用常规分型方法即荧光直接标记微卫星引物的方法成本过于昂贵。购买大量荧光引物的高昂成本和大批量重复的PCR扩增分型操作成为实际应用中最主要的限制条件。继而本研究为解决高通量微卫星分型的问题，在前人三引物分型系统的基础上，提出使用四种新的通用荧光引物，再利用多重PCR进行微卫星的分型。对于每一个位点的PCR体系包含:一条改造过的上游引物（5'端连有通用引物序列）、一条普通的下游引物和一段通用荧光引物。通过拓展三引物系统，运用分别带有四种不同颜色荧光的四条不同通用引物，达到在一轮PCR中对8个、12个甚至更多位点进行基因分型的目的。只需要订购一批次的荧光引物，即可对任意位点进行分型，这大大提高了荧光引物的使用效率。这一分型方法在截形叶螨的徐州种群(XZ)中进行了检验，并为了验证其通用性，此方法还在神泽叶螨、花蓟马和褐飞虱中进行了验证。与传统的分型结果相比，新分型方法得到的结果信号强度普遍有所减弱，但仍完全可以清晰识别等位基因，且其片段长度与传统分型方法保持一致。
　　本研究最后通过自行开发的16个微卫星位点和线粒体COI基因序列，对中国22个截形叶螨种群共计1159个样本进行了种群遗传结构的研究。分析发现相较于其他叶螨，我国的截形叶螨除JQ和JMN种群外多样性较高，种群间分化较大。使用贝叶斯聚类，我们将中国的截形叶螨种群分为两个大的分支，且两个分支组分随着温度带的变化而有规律的变化。由于有较强的IBD效应，我们认为气候条件和地理隔离是引起截形叶螨种群核基因遗传分化的主要因素。基于COI基因的统计显示共含有19个单倍型，除JMN、JQ和XZZ三个种群只有一种单倍型外，其余种群单倍型和核酸多样性较好。Wolbachia感染率从最低的2.82％(ZJ)至最高的80.39％(BTB)不等。检测wsp基因共发现11种序列型分属于Ori和Con两种株系。Ori株系是广泛存在于各种群的(除了JMN)，Con株系则局限于JMN、ZZ、BTB和BTC种群。超感染现象主要存在与BTB和BTC种群。Wolbachia虽然与单倍型没有明显的一一对应关系，但对于COI的分化起到显著作用。对中国22个截形叶螨地理种群的遗传结构及寄生菌Wolbachia的感染情况进行综合分析，可以得出结论截形叶螨种群核基因分化水平与地理距离呈正相关，且与气候带分布关系密切，而与Wolbachia无关。研究结果有助于深入了解截形叶螨暴发的机理和种群高度分化的原因，并为截形叶螨防治工作提供理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．种群遗传学中常用的分子遗传标记

1．1 第—代分子标记技术

1．2 第二代分子标记技术

1．3 第三代分子标记技术(SNPs)

1．4 线粒体DNA分子标记

2．微卫星的开发方法

2．1 传统文库开发

2．2 基于探针杂交的微卫星富集文库开发

2．3 FIASCO法

2．4 基于NGS测序的开发方法

2．5 基于EST数据库的微卫星开发

2．6 利用近源种微卫星转移开发

3．截形叶螨及其发生规律

3．1 截形叶螨及其为害概况

3．2 截形叶螨鉴定以及生物学特征

3．3 截形叶螨近年来在我国的发生规律

4．叶螨种群遗传结构与遗传多样性研究进展

4．1 叶螨常见研究对象和分子标记方法

4．2 遗传多样性分析常用分子标记与叶螨遗传多样性的研究

4．3 遗传结构分析常用统计指标、分析软件与叶螨的遗传结构研究

4．4 种群遗传学在叶螨生态学研究中的应用

第二章 形态与分子相结合的叶螨鉴定

1．材料与方法

1．1 叶螨采集

1．2 标本制作与形态学鉴定

1．3 提取叶螨总DNA

1．4 PCR扩增ITS片段

1．5 酶切反应

1．6 图谱对比鉴定

2．结果与分析

2．1 样本种类的形态学鉴定结果

2．2 RFLP鉴定结果

3．讨论

第三章 基于微卫星转移特性的截形叶螨微卫星开发

1．材料与方法

1．1 叶螨的采集与鉴定

1．2 利用信息学方法筛选微卫星标记

1．3 DNA提取和引物测试

1．4 对筛选得到的微卫星重额进行测序确认

1．5 数据分析

2．结果与分析

2．1 基于计算机的微卫星开发

2．2 实验室进行实际微卫星开发

2．3 微卫星的特征

2．4 跨物种转移性

3．讨论

第四章 基于三引物体系的多重PCR微卫星分型

1．材料与方法

1．1 叶螨的采集与鉴定

1．2 DNA提取与引物准备

1．3 基因分型

1．4 分型方法通用性检测

1．5 数据分析

2．结果与分析

3．讨论

第五章 基于微卫星和线粒体的截形叶螨种群遗传结构研究

1．材料与方法

1．1 叶螨的采集与鉴定

1．2 DNA的提取

1．3 微卫星的扩增及分型

1．4 线粒体DNA的扩增测序

1．5 Wolbachia分型及分析

1．6 数据处理

2．结果与分析

2．1 种群内的遗传多样性

2．2 种群问遗传分化

2．3 IBD效应分析

2．4 截形叶螨的种群遗传结构

2．5 MtDNA多样性

2．6 Wolbachia分析

3．讨论

全文总结

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术研究论文

致谢