胰腺特异性表达载体PDX1-Hes1的构建及表达验证研究

摘要

器官移植是治疗人类器官衰竭，挽救人类生命的有效方法。但器官移植供体严重短缺，远远不能满足患者的需要。随着科学研究的深入和科学技术的提高，异种器官移植逐渐成为医学研究领域的热点。小型猪的血液生理生化指标与人类接近，器官大小也接近于人，生长周期又短，因此小型猪可以作为制备特殊器官的生物反应器，成为异种器官移植供体来源的最佳提供者。随着转基因技术和诱导多能干细胞(iPS)研究的发展，利用人诱导多能干细胞进行人猪嵌合，在猪体内长出人的器官成为器官移植供体可靠来源之一。
　　糖尿病和胰腺癌都有造成胰腺器官衰竭的可能，随时都有生命危险，随着我国经济能力的提高和医院移植技术的不断完善，糖尿病和胰腺癌患者对胰腺移植的需求与日俱增，但胰腺移植也面临同样的问题，供体严重缺乏，配型困难。利用人猪嵌合技术，在胰腺缺陷的猪胚胎中注入患者的诱导多能性干细胞，让猪体内长出病人的胰腺，不仅解决了糖尿病和胰腺癌患者胰腺移植供体不足的问题，同时也实现了个性化器官移植，减少免疫排斥。要实现这项生产胰腺的伟大工程，首先我们要制备出胰腺缺陷的猪胚胎。
　　PDX1在胰腺生长发育过程中扮演重要角色，特异地表达于胰腺中;Notch信号通路对早期胰腺发育及胰腺细胞命运决定起到重要的调节作用，Hes1是Notch信号通路下游重要的调控转录效应因子，其基因编码的蛋白主要负责转录抑制，通过转录抑制影响胚胎发育期的细胞增殖和分化。本研究以eGFP为报告基因，Hes1为目的基因，构建了胰腺特异性表达载体PDX1-eGFP和PDX1-Hes1。通过体外转染小鼠胰岛β细胞试验来验证载体在体外的特异性表达，通过制备转基因小鼠的试验来验证载体在体内的特异性表达情况以及对胰腺缺陷动物模型的制备进行相关探索，本研究为制备胰腺缺陷猪胚胎奠定基础。主要试验结果如下:
　　试验一:胰腺特异性表达载体PDX1-eGFP和PDX1-Hes1的构建及体外验证。成功构建了PDX1-eGFP和PDX1-Hes1这两个载体。PDX1-eGFP转染小鼠胰岛β细胞和成纤维细胞48 h后，荧光显微观察结果为在小鼠胰岛β细胞中发光，而在非胰腺细胞的成纤维细胞中不发光，说明PDX1-eGFP的表达具有胰腺特异性转染48 h，提取细胞蛋白，开始用Western Blot检测。得到的结果是，小鼠胰岛β细胞蛋白有eGFP表达，成纤维细胞蛋白无eGFP表达，同样说明PDX1-eGFP的表达具有胰腺特异性。PDX1-Hes1和空载体分别转染小鼠胰岛β细胞48 h后，提取RNA和蛋白，经实时荧光定量PCR实验和Western Blot分析，结果均显示，Hes1在转PDX1-Hes1的小鼠胰岛β细胞中的表达量显著高于转空载体的小鼠胰岛β细胞，这说明PDX1-Hes1可以使Hes1基因在胰腺细胞中特异性过表达。
　　试验二:PDX1-eGFP和PDX1-Hes1在小鼠体内的表达研究。通过转基因小鼠的制备，成功获得了1只PDX1-eGFP小鼠和2只PDX1-Hes1小鼠。PDX1-eGFP小鼠通过RT-PCR实验和Western Blot分析，结果均表明，eGFP在PDX1-eGFP小鼠的胰腺中表达，而在PDX1-eGFP小鼠的肝中与对照小鼠的胰腺和肝脏中均不表达;更有说服力的一个结果是，通过活体荧光观察，PDX1-eGFP小鼠仅胰腺部位有明显绿色荧光，而PDX1-eGFP小鼠的其他部位和对照小鼠的全身均无绿色荧光。这说明eGFP在PDX1启动子的启动下在小鼠体内的胰腺中特异性表达。PDX1-Hes1小鼠通过RT-PCR实验和实时荧光定量PCR实验，结果均显示，Hes1在PDX1-Hes1小鼠胰腺中的表达明显高于对照组小鼠胰腺;PDX1-Hes1小鼠虽未造成胰腺缺陷，但从解剖形态观察上看，胰腺还是存在一定程度异常的，这可能跟载体的保存方式、载体的完整度、载体真正的浓度、载体插入的随机性、Hes1过表达的量等有关。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词

第一篇：文献综述

第一章：异种器官移植研究

1 异种器官移植

2 免疫排斥

3 诱导型多能性干细胞

4 糖尿病与胰腺癌

参考文献

第二章：胰腺发育相关基因与信号通路

1 PDX1基因

2 Hes1基因

3 Notch信号通路

参考文献

第二篇：试验部分

第一章：胰腺特异性表达载体的构建及体外验证

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

参考文献

第二章：载体PDX1-eGFP和PDX1-Hes1在小鼠体内的表达研究

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

参考文献

全文结论

致谢

硕士期间发表的论文