新型转基因棉花对棉田节肢动物群落的影响及棉铃虫田间种群Cry2Ab抗性等位基因的F2检测

摘要

棉花是一种重要的经济作物，我国是世界级产棉大国，棉花产量多年稳居世界第一，因此棉花在我国种植业中具有很重要的地位。但是一直以来棉铃虫Helicoverpaarmigera（Hübner）的为害是棉花生产的主要威胁，化学防治是控制其为害的主要方法。此种方法虽然见效快，但是对环境污染严重，而且更重要的是棉铃虫由于自身的生物学特性导致其极易对各类杀虫剂产生抗性。上个世纪80年代末到90年代初棉铃虫对化学杀虫剂的抗性大暴发，给棉花生产造成了重大损失。随着科学技术的发展和农业生物技术的进步，我国在1997年开始推广种植转Bt基因抗虫棉（即第一代转Cry1Ac毒素基因抗虫棉），由于其对靶标害虫棉铃虫良好的控制作用，种植范围迅速扩大，到2014年全国转Bt基因抗虫棉的种植面积已达到390万公顷，占全国棉花种植面积的93％。随着转Bt基因抗虫棉的广泛推广应用，棉田主要害虫棉铃虫的数量得到了有效控制，同时也减少了化学杀虫剂的使用，有效保护了天敌，改进了农田生态系统，表现出了明显的经济效益、社会效益和环境效益。
　　为了克服棉铃虫可能对转Bt基因抗虫棉产生抗性，在抗虫棉推广的伊始就提出了抗性治理的高剂量避护所策略，后来又引入基因叠加策略即转双价Bt基因抗虫棉的应用。虽然有抗性治理的预案，但随着转Bt棉花在各国的广泛种植，长期的选择压力导致的棉铃虫对转Bt基因抗虫棉的抗性，仍然是棉花生产中的重大问题。因此寻找新的抗虫策略极为必要，利用植物表达与昆虫特定基因匹配的dsRNA的RNAi技术控制害虫成为了最新的选择。本研究对转入棉铃虫激素合成代谢途径中起关键作用基因的dsRNA的棉花进行了对棉田节肢动物群落影响的调查，以全面评价这类新型转基因棉花的生物安全性。另外采用F2检测方法对我国各大棉区的棉铃虫对Cry2Ab毒素抗性基因的频率进行了调查。本文的研究结果对于指导转基因抗虫棉的未来发展以及棉铃虫Bt抗性的治理具有重要意义。
　　1.新型转基因棉花对棉田节肢动物群落的影响
　　具有全新抗虫策略的转dsRNA棉花是一种理论上有效的控制棉铃虫为害的新型转基因棉花，对其开展对棉田靶标害虫棉铃虫、非靶标害虫及天敌影响的调查，是转基因作物生物安全评价的一项重要内容，也是考量这类新型转基因棉花未来应用前景的一个重要方面。本研究以两种表达与昆虫激素相关基因的dsRNA的转基因棉花（新型转基因棉花）、转单价和双价Bt基因抗虫棉以及常规棉为对象，系统调查了在棉花生长季中棉田棉铃虫、其它非靶标害虫和蜘蛛、瓢虫、草蛉等天敌的数量变化，分析了棉田节肢动物群落组成并采用群落多样性指数、优势度指数和丰富度指数等参数评价了不同类型棉田节肢动物的情况等。结果显示除了常规非抗虫棉的咀嚼式口器害虫数量明显高于其它类型棉田外，余下各种类型棉田群落组成没有差异，各个生物学参数间也没有发现差异。因此，新型转基因棉花对棉田的非靶标害虫和天敌无不利影响，但从棉铃虫的数量及为害情况看，新型转基因棉花比转Bt基因棉花对靶标害虫棉铃虫的效果要差，要想将此类棉花应用于生产实际可能还需要更多的工作。
　　2.各地区棉铃虫田间种群Cry2Ab抗性等位基因的F2检测
　　2014年对河南安阳、山东夏津、河北廊坊、新疆沙湾4个地区的田间棉铃虫种群对Cry2Ab毒素的抗性等位基因频率进行了F2检测。河南安阳的田间棉铃虫种群，建立了251个单雌系，检测了其中109个，检测出抗性单雌系数量11个，抗性等位基因数量11个，抗性等位基因频率为0.025;山东夏津的田间棉铃虫种群，建立的单雌系数量为176个，检测了其中63个，检测出抗性单雌系数量6个，抗性等位基因数量7个，抗性等位基因频率为0.028;河北廊坊的田间棉铃虫种群建立单雌系350个，检测了其中58个，检测出抗性单雌系数量14个，抗性等位基因数量14个，抗性等位基因频率为0.060;新疆沙湾田间棉铃虫种群建立单雌系150个，检测其中77个，检测出抗性单雌系数量为0，抗性等位基因数量0，抗性等位基因频率为0.000。本实验的研究结果可以看出，虽然我国还没种植转双价Bt基因抗虫棉，但种植Cry1Ac棉花历史比较长的地区，Cry2Ab毒素蛋白抗性基因频率明显较高，因此是否种植双价Bt棉花时应保持谨慎态度。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 棉铃虫的生物学特性及其危害

2 转基因棉花

2．1 转基因棉花的研究概况

2．2 转基因棉花造成的环境安全风险

2．3 转基因棉花环境安全性评价

3 Bt毒素

3．1 苏云金芽孢杆菌

3．2 Bt毒素种类和命名

3．3 Bt毒素的应用

4 害虫对Bt作物的抗性检测技术

4．1 剂量对数—死亡机率值法(抗性倍数法)

4．2 区分剂量法

4．3 F1筛选法

4．4 F2筛选法

4．5 DNA分子检测法

5 Bt抗性治理策略

6 本研究的目的和意义

第二章 新型转基因棉花对棉田节肢动物群落的影响

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 调查方法

1．3 调查内容

1．4 数据处理

2 结果与分析

2．1 靶标害虫的田间变化动态

2．2 非靶标害虫的田间变化动态

2．3 天敌的田间变化动态

2．4 节肢动物群落结构分析

2．5 节肢动物群落优势度、多样性和丰富度指数分析

3 讨论

第三章 棉铃虫田间种群Cry2Ab抗性等位基因的F2检测

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 Cry2Ab毒素

1．3 生物测定方法

1．4 数据分析

2 结果与分析

2．1 田间棉铃虫种群对Cry2Ab抗性的F2筛选

2．2 田间棉铃虫种群F2筛选的亲本抗性等位基因型估算

2．3 田间棉铃虫种群抗性等位基因频率的估算

3 讨论

全文总结

参考文献

致谢