伴矿景天金属硫蛋白基因SpMT2a和SpMT2b的克隆及功能分析

摘要

金属硫蛋白(metallothionein，MTs)是一类富合半胱氨酸(Cys)且具有金属结合能力的低分子量蛋白，广泛分布于微生物、植物以及动物中，植物MTs参与了细胞中金属稳态、解毒以及活性氧(ROS)清除过程。为阐明超积累植物伴矿景天的重金属耐性和解毒的分子机理，分离相关基因，本论文克隆了伴矿景天中的两个金属硫蛋白基因，并对其结构、表达特征及功能进行了研究。取得的主要研究结果如下:
　　利用RT-PCR和RACE技术，从伴矿景天叶片中成功克隆到两个金属硫蛋白基因，分别命名为SpMT2a（GenBank登录号:KJ817855）和SpMT2b(GenBank登录号:KJ817856)。序列分析表明，SpMT2a和SpMT2b都含有一个240 bp的完整开放阅读框(ORF)，编码79个氨基酸残基，基因组序列都含有一个内含子，大小分别为99 bp和240 bp。
　　生物信息学分析表明，SpMT2a和SpMT2b氨基酸序列与拟南芥、丹参和天蓝遏蓝菜的MT2s序列一致性达60-70％,均含有14个半胱氨酸(Cys)残基，这些Cys残基在肽链中具有典型的排列方式，即在N端按照CC、CXC、CXC、CXXC，C端按照3个CXC的方式排列。系统进化树分析表明，SpMT2a与白三叶草TrMT2亲缘关系较近，而SpMT2b则与蒺藜苜蓿MtMT2亲缘关系较近。组织特异性表达分析表明，SpMT2b主要在地上部表达，SpMT2a在地上部和根部的表达量基本一致，且表达量明显高于SpMT2b。锌(Zn)或镉(Cd)均能够诱导SpMT2b表达的上调，但SpMT2a几乎不受Zn或Cd的诱导表达。
　　构建了p424-SpMT2a和p424-SpMT2b酵母表达载体，将其转入酵母金属硫蛋白CUP1及转录因子yap缺失突变体中。功能互补试验表明，SpMT2a和SpMT2b的表达能够明显提高酵母突变体对100μM Cu和60μM Cd的耐性。
　　综上，SpMT2a和SpMT2b是Zn/Cd超积累植物伴矿景天中的金属硫蛋白基因，能够提高酵母菌对Cu或Cd的耐性，但在伴矿景天维持金属稳态或金属解毒过程中可能具有不同的作用。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 重金属对植物的毒害作用

1．2．1 对植物生长发育的影响

1．2．2 引起氧化胁迫和膜的损伤

1．2．3 对植物光合作用和蒸腾作用的影响

1．2．4 对营养元素吸收的影响

1．3 植物耐重金属的解毒机理

1．3．1 区隔作用

1．3．2 螯合作用

1．3．3 抗氧化作用

1．4 植物吸取修复技术与超积累植物

1．5 植物金属硫蛋白研究进

1．5．1 植物金属硫蛋白的分类

1．5．2 植物金属硫蛋白基因的结构

1．5．3 植物金属硫蛋白基因的表达

1．5．4 植物金属硫蛋白的结构

1．5．5 植物金属硫蛋白的功能

1．6 本文研究的目的和意义

1．7 本研究的技术路线

第二章 SpMT2a和SpMT2b基因克隆及序列分析

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 材料与试剂

2．2．2 方法与步骤

2．3 结果与分析

2．3．1 SpMT2a和SpMT2b的克隆

2．3．2 SpMT2a和SpMT2b的生物信息学分析

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 SpMT2a和SpMT2b基因的表达模式分析

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料与试剂

3．2．2 方法与步骤

3．3 结果与分析

3．3．1 SpMT2a和SpMT2b的组织特异性表达

3．3．2 不同浓度的Zn对伴矿景天SpMT2a和SpMT2b表达的影响

3．3．3 不同浓度的Cd对伴矿景天SpMT2a和SpMT2b表达的影响

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 酵母功能互补试验及重金属耐性分析

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 材料与试剂

4．2．2 方法和步骤

4．3 结果与分析

4．3．1 酵母表达载体p424-SpMT2a和p424-SpMT2b的构建

4．3．2 SpMT2a和SpMT2b在酵母突变体中的功能分析

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 全文总结

5．1 本研究主要结论

5．2 本研究创新之处

5．3 本研究不足之处

5．4 研究展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间论文发表与撰写情况

致谢