奶山羊Scd1基因克隆及其在乳腺上皮细胞中表达的研究

摘要

硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)是△-9去饱和酶，能够催化C14～C19饱和脂肪酸生成相应的单不饱和脂肪酸(MUFA)，在调控脂肪酸合成过程中具有重要的作用。SCD1蛋白主要以硬脂酸(C18∶0)和棕榈酸(C16∶0)为底物，催化其生成油酸(C18∶1 n-9)和棕榈油酸(C16∶1 n-7);同时还能催化trans11-C18∶1（t11-C18∶1）生成cis9，trans11-共轭亚油酸(c9，t11-CLA)。MUFA和共轭亚油酸(CLA)具有调节血液中胆固醇含量，防止心血管疾病，提高免疫力等作用，因此，这类不饱和脂肪酸有益于人类的身体健康。SCD1是MUFA合成过程的关键酶，提高乳腺中SCD1蛋白的表达量或活性可以有效的提高乳中不饱和脂肪酸含量，同时降低饱和脂肪酸含量。目前，关于在奶山羊乳腺中特异性表达奶山羊硬脂酰辅酶A去饱和酶1基因（Scd1）的研究尚未见报道。
　　鉴于此，本试验以奶山羊Scd1基因为研究对象，首先，分离、纯化奶山羊乳腺上皮细胞，建立检测乳腺上皮细胞分泌功能的绿色荧光蛋白报告系统;其次，克隆Scd1基因编码区序列并验证其表达产物的生物学活性;然后，探究Scd1基因对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因表达的影响;最后，构建Scd1基因乳腺特异性表达载体，并在体外培养的乳腺上皮细胞中验证该载体的有效性。主要研究结果如下:
　　1.奶山羊乳腺上皮细胞的分离培养及荧光报告系统的建立
　　保留乳腺分泌特性的奶山羊乳腺上皮细胞是研究乳腺发育、分化、退化以及乳腺生物反应器的理想模型。本试验旨在分离培养奶山羊乳腺上皮细胞、优化细胞培养条件并建立一种更加简便、有效地检测乳腺上皮细胞分泌功能的荧光报告系统。首先，采用组织块培养法和胰酶消化法分离纯化了奶山羊乳腺上皮细胞，比较了血清、ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒复合物）和胰岛素对细胞生长曲线、细胞周期、细胞凋亡和转染效率的影响。其次，将EGFP基因编码区序列插入到含有山羊β-酪蛋白基因启动子的pBC1载体中，构建绿色荧光蛋白报告载体pBC1-EGFP，脂质体介导法转染奶山羊乳腺上皮细胞，采用RT-PCR法和荧光观察法分别在RNA水平和蛋白水平检测EGFP的表达。最后，为验证荧光报告系统的有效性，采用免疫荧光法和Western blot法分别检测乳腺上皮细胞的纯度和分泌特性。结果显示，分离纯化的乳腺上皮细胞生长状态良好，细胞形态呈鹅卵型;通过比较不同培养条件下，细胞的增殖、周期、凋亡和转染效率，选定10ITS组（10％ FBS+1％ ITS+5μg/mL氢化可的松+10 ng/mL EGF）作为后续试验中奶山羊乳腺上皮细胞的培养条件;EGFP基因能够在乳腺上皮细胞中诱导表达;在乳腺上皮细胞中，细胞角蛋白18强表达，波形蛋白有微弱表达;乳腺上皮细胞能够合成β-酪蛋白。以上结果表明:(1)分离、纯化的奶山羊乳腺上皮细胞具有分泌功能，可以作为后续试验的细胞模型;(2)β-酪蛋白启动子驱动的绿色荧光蛋白报告系统，可以有效地检测乳腺上皮细胞的分泌功能，为今后鉴定乳腺上皮细胞分泌特性提供了一种简便、有效的荧光报告系统。
　　2.Scd1基因克隆及其表达产物的生物学活性研究
　　为获得Scdl基因CDS区序列，并在细胞中验证其表达产物的生物学活性。本试验采用RT-PCR法从泌乳期萨能奶山羊乳腺组织中扩增得到Scd1基因编码区全序列，并克隆至pMD(R)19-T载体上，构建了pMD-SCD1载体，测序分析Scd1基因的序列。以pEGFP-N1为骨架载体，构建Sd1基因融合表达载体pN1-SCD1，转染乳腺上皮细胞，通过EGFP荧光表达情况，研究SCD1蛋白在细胞中的定位。同时，以pIRES2-EGFP载体为骨架，构建Scd1基因的真核表达载体pSCD1-EGFP，脂质体介导法转染奶山羊耳成纤维细胞，实时荧光定量PCR法检测Scd1基因在mRNA水平的表达，气相色谱法分析SCD1蛋白对细胞脂肪酸组成的影响。测序结果显示:所获得的Scd1基因CDS区序列与Gene Bank公布的序列同源性为100％; SCD1-EGFP融合蛋白荧光表达结果显示:SCD1蛋白定位在细胞质中;qRT-PCR结果显示:在转染pSCD1-EGFP载体的耳成纤维细胞中，Scd1基因mRNA的表达量是对照组的16.5倍;脂肪酸分析结果显示:过表达Scd1基因后，显著提高了细胞内棕榈油酸（16∶1 n-7，1.73±0.02％ vs.2.54±0.02％，P＜0.01）和油酸（18∶1 n-9，27.25±0.13％ vs.30.37±0.04％，P＜0.01）的含量。本试验克隆得到了Scd1基因的CDS区序，并证实了该基因的表达产物具有生物学活性。为研究Scd1基因在脂肪酸代谢中的功能及Scd1乳腺特异性表达载体的构建奠定了基础。
　　3.Scd1基因对脂肪酸代谢相关基因表达的影响
　　乳腺中，与乳脂合成、分解和调控相关的基因众多，形成复杂的脂代谢基因调控网络。然而，关于Scd1基因对其它脂肪酸代谢相关基因表达影响的研究较少。本试验采用过表达和干扰Scd1基因法，在奶山羊乳腺上皮细胞中，研究了Scd1基因对脂肪酸代谢相关基因表达水平的影响。首先，以pCAGGS为骨架载体，构建了pCAG-SCD1过表达载体，通过PCR、酶切和测序，鉴定了载体构建的正确性。其次，设计、合成了3对，cd1 siRNA序列并筛选出高效的干扰序列，将Scd1基因过表达载体和干扰序列分别转染乳腺上皮细胞，采用qRT-PCR法检测脂肪酸代谢相关基因表达的变化。qRT-PCR结果显示，过表达Scd1基因后，甘油三酯合成相关基因（Agpat6、 Dgat1）和脂滴形成相关基因（Adrp、Tip47）的表达显著上升;干扰Scd1基因表达后，甘油三酯合成相关基因（Gpam）和脂滴形成相关基因（A却、Tip47）的表达则显著下降。结果表明，Scd1基因可能参与调控了甘油三酯和脂滴形成相关基因的表达，进而影响了甘油三酯的合成和脂滴的形成。本试验为进一步研究Scd1基因在脂肪酸代谢中的重要功能奠定了基础。
　　4.Scd1基因乳腺特异性表达载体构建及其在乳腺上皮细胞中表达研究
　　若提高乳腺中Scd1基因的表达量或活性，可以有效地增加乳中不饱和脂肪酸的含量，并降低饱和脂肪酸的含量。本试验旨在构建Scd1基因乳腺特异性表达载体并在体外验证该载体的有效性，为转Scd1基因奶山羊的制备提供有效载体。首先，将已克隆的萨能奶山羊Scd1基因插入到含有山羊β-酪蛋白基因调控序列的pBC1载体中，获得重组载体pBC1-SCD1。同时，为了后期转基因供体细胞筛选的需要，将新霉素抗性基因(Neo)和绿色荧光蛋白(EGFP)基因插入到pBC1-SCD1载体中，并在标记基因两侧插入了用于标记基因删除的LoxP同向重复序列，获得载体pBC1-SCD1-LNIE。然后，将鉴定正确的pBC1-SCD1-LNIE载体，采用脂质体介导法转染奶山羊乳腺上皮细胞，经催乳素诱导培养，qRT-PCR和Western blot法检测Scd1基因的表达，验证载体的有效性。PCR、酶切和测序鉴定结果表明，成功构建了Scd1基因乳腺特异性表达载体pBC1-SCD1-LNIE; qRT-PCR结果显示，Scd1转染组中Scd1基因的mRNA表达量是对照组的14.1倍;Western blot结果显示，Scd1转染组中SCD1蛋白的表达量是对照组的7倍。本试验成功构建了Scd1基因乳腺特异性表达载体，并证实该载体能够在乳腺上皮细胞中诱导表达。为后续转Scd1基因克隆奶山羊供体细胞的制备及富含不饱和脂肪酸羊乳的生产奠定了基础。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词(Abbreviation)

引言

参考文献

第一章 乳脂肪酸组成的调控

1 反刍动物的脂肪酸代谢

1．1 瘤胃中脂肪酸的代谢

1．2 脂肪组织中脂肪酸的代谢

1．3 乳腺中脂肪酸的代谢

2 乳中脂肪酸组成的调控

2．1 改变日粮组成

2．2 添加脂肪(酸)

2．3 品种选育

3 羊乳脂肪酸组成的调控

参考文献

第二章 Scd1基因的研究进展

1 Scd基因的种类、分布与结构

1．1 Scd基因的种类

1．2 Scd基因的分布

1．3 Scd基因的结构

2 SCD1蛋白的作用

3 Scd1基因的表达调控

3．1 日粮饲喂试验研究脂肪酸对Scd1基因的表达调控

3．2 体内试验研究特定脂肪酸对Scd1基因的表达调控

3．3 体外试验研究特定脂肪酸对Scd1基因的表达调控

4 Scd1基因的表达调控机制

参考文献

第三章 奶山羊乳腺上皮细胞的分离培养及荧光报告系统的建立

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要仪器用品

1．3 主要试剂

1．4 主要溶液的配制

1．5 试验方法

1．6 数据统计与分析

2 结果

2．1 奶山羊乳腺上皮细胞形态观察

2．2 乳腺上皮细胞培养条件的优化

2．3 CSN2启动子驱动的绿色荧光蛋白报告载体的构建及鉴定

2．4 EGFP基因在乳腺上皮细胞中的诱导表达

2．5 乳腺上皮细胞中细胞骨架蛋白的表达

2．6 乳腺上皮细胞中β-酪蛋白的表达

3 讨论

参考文献

第四章 Scd1基因克隆及其表达产物的生物学活性研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要仪器用品

1．3 主要试剂

1．4 主要溶液的配制

1．5 试验方法

1．6 数据统计与分析

2 结果

2．1 Scd1 cDNA的扩增

2．2 pSCD1-EGFP载体的构建与鉴定

2．3 无终止密码子Scd1 cDNA的扩增

2．4 pN1-SCD1载体的构建与鉴定

2．5 SCD1蛋白在奶山羊乳腺上皮细胞的定位

2．6 Scd1基因在奶山羊耳成纤维细胞中的表达

2．7 Scd1以基因过表达对奶山羊耳成纤维细胞中脂肪酸组成的影响

3 讨论

参考文献

第五章 Scd1基因对脂肪酸代谢相关基因表达的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要仪器用品

1．3 主要试剂

1．4 主要溶液的配制

1．5 试验方法

1．6 数据统计与分析

2 结果

2．1 pCAG-SCD1载体的构建与鉴定

2．2 Scd1基因的表达效率检测

2．3 Scd1基因对脂肪酸代谢相关基因的影响

3 讨论

3．1 Scd1与脂肪酸的从头合成

3．2 Scd1与甘油三酯的合成

3．3 Scd1与脂滴的形成

3．4 Scd1与甘油三酯的水解

3．5 Scd1与SREBP-1信号通路

3．6 Scd1与PPARγ信号通路

参考文献

第六章 Scd1基因乳腺特异性表达载体构建及其在乳腺上皮细胞中表达研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要仪器用品

1．3 主要试剂

1．4 主要溶液的配制

1．5 试验方法

1．6 数据统计与分析

2 结果

2．1 pBC1-SCD1载体构建与鉴定

2．2 pBC1-SCD1-LNIE乳腺特异性表达载体构建与鉴定

2．3 Scd1基因在奶山羊乳腺上皮细胞的诱导表达

3 讨论

参考文献

全文结论

创新点

致谢

攻读博士期间发表的论文