番茄TYLCV抗性相关TETRASPANIN3基因克隆与功能分析

摘要

番茄是我国重要的蔬菜，目前番茄黄化曲叶病(TYLCV)在世界各地均有不同程度地发生，已经成为番茄最严重的病害之一。受番茄黄化曲叶病毒感染的番茄植株会出现矮化，叶片缩小，黄化并且卷曲，番茄生长、开花和坐果受到严重影响，使番茄减产。通过基因工程来提高番茄的抗病性，在番茄育种中的应用日益受到重视。通过克隆与抗TYLCV有关基因的基因导入植物体内，或者抑制利于TYLCV侵染植物的基因的表达，可以提高植物对TYLCV的抗性。根据TYLCV诱导后番茄的转录组数据得到，TETRASPANIN3在被TYLCV诱导后出现显著上调表达，表明TETRASPANIN3可能与番茄对TYLCV的抗性有关，因此TETRASPANIN3可能成为抗TYLCV番茄育种的目的基因。
　　TETRASPANIN蛋白是具有高度保守的氨基酸序列和特殊结构的膜蛋白，蛋白高度保守性表明TETRASPANIN基因家族具有相似或者相近的功能。番茄中TETRASPANIN3功能未见报道。本研究拟探索TETRASPANIN3基因在抗TYLCV病中的作用及对番茄生长发育的影响，以期为将TETRASPANIN3基因运用于番茄抗TYLCV育种工作提供理论依据。取得主要结果如下:
　　通过利用NCBI数据库及软件MEG5.0构建出TETRASPANIN3的进化树，结果表明TETRASPANIN3基因与葡萄中VITIS VINIFERA基因在一个独立的分支上，与其它物种亲缘关系较远。采用荧光定量PCR检测TETRASPANIN3在番茄各个器官中的表达量。结果表明;TETRASPANIN3在番茄各个器官中均有表达。在茎、老叶、花中的相对表达量较高，在根和果实中的相对表达量较低，而在新生叶中相对表达量处于中间水平。研究TETRASPANIN3对TYLCV侵染的响应，通过荧光定量得到TYLCV侵染番茄3d，7d时，TETRASPANIN3相对表达水平。可以看出，当病毒侵染番茄后，TETRASPANIN3出现上调表达，与接种TYLCY后番茄RNA-seq得到的数据一致，表明番茄基因TETRASPANIN3与TYLCV侵染有关。
　　为进一步研究番茄TETRASPANIN3的功能，利用VIGS技术将番茄中的TETRASPANIN3沉默，观测沉默植株的表型并检测沉默植株的抗病性。用番茄PDS基因（八氢番茄红素脱氢酶基因）作为实验的阳性对照。番茄植株注射PDS基因2-3周后，叶片表现出白化表型，表明PDS基因已被沉默。此时，检测TETRASPANIN3的表达量，沉默植株TETRASPANIN3的表达量达约为对照组（TRV空载体）的35％，达到显著沉默效果。 TETRASPANIN3沉默后番茄植株出现一种与对照组有显著差异的表型，TETRASPANIN3被沉默后，番茄叶片出现严重的扭曲，表明该基因与番茄叶片的生长发育有关，这与其同源基因TORNADO1和TORNADO2影响拟南芥根部径向分化和平周分化相似，对植物的生长发育都有影响。将TETRASPANIN3沉默植株接种TYLCV。对接种后的TYLCV病毒量检测发现，沉默植株中TYLCV病毒量比对照组低50％以上，表明TETRASPANIN3表达被抑制后，降低TYLCV对番茄植株的侵染程度，番茄对TYLCV的抗性增强。
　　通过RT-PCR克隆番茄的TETRASPANIN3基因，并构建TETRASPANIN3基因过量表达的植物表达载体，通过农杆菌介导转化烟草，T0转基因烟草自交获得T1代，用番茄黄化曲叶病毒接种T1转基因烟草，通过荧光定量PCR检测烟草叶中的病毒量从而检测其抗性，结果发现，转TETRASPANIN3基因烟草叶片所含病毒量远高于非转基因烟草叶片所含病毒量，表明TETRASPANIN3基因有利于TYLCV对烟草的侵染。
　　通过以上实验结果得出结论:TETRASPANIN3与番茄叶片的生长发育有关，并且对TYLCV侵染番茄植株起正调控作用。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 文献综述

1 番茄黄化曲叶病

1．1 番茄黄化曲叶病毒

1．2 番茄黄化曲叶病的病症、危害及分布

1．3 番茄黄化曲叶病的防治

1．4 抗番茄黄化曲叶病番茄品系的培育

1．5 抗番茄黄化曲叶病番茄基因工程育种

2．TETRASPANIN3基因

2．1 TETRASPANIN基因家族及进化

2．2 TETRASPANIN蛋白结构

2．3 TETRASPANIN的功能

2．4 植物中的TETRASPANIN

3．本研究的目的和意义

第二章 番茄TYLCV抗性相关TETRASPANIN3基因克隆与表达分析

1 材料与方法

1．1 番茄品种及主要试剂、仪器

1．2 TETRASPANIN3基因克隆

1．3 TETRASPANIN3基因序列的生物信息学分析

1．4 总RNA的提取

1．5 cDNA第一链的合成

1．6 实时荧光定量PCR引物设计、反应体系及程序

1．7 器官表达量分析

1．8 番茄接种TYLCV

2 结果与分析

2．1 TETRASPANIN3基因序列

2．2 氨基酸序列保守结构域分析

2．3 TETRASPANIN3基因系统进化分析

2．4 提取用于组织表达分析的番茄总RNA

2．5 TETRASPANIN3基因器官表达

2．6 提取用于番茄诱导表达分析的总RNA

2．7 TETRASPANIN3基因诱导表达

3 讨论

第三章 TETRASPANIN3基因沉默对番茄表型和抗病性的影响

1 材料与方法

1．1 番茄品种、菌株、载体

1．2 植物总RNA提取提取

1．3 cDNA的合成

1．4 TETRASPANIN3基因沉默载体的构建

1．5 TETRASPANIN3基因PCR扩增

1．6 TETRASPANIN3基因PCR扩增产物纯化

1．7 TETRASPANIN3基因与pTRV2载体的酶切

1．8 TETRASPANIN3基因酶切产物的纯化

1．9 pTRV2载体酶切后胶回收

1．10 TETRASPANIN3基因与pTRV2载体连接

1．11 LB培养基的配制

1．12 连接产物转化大肠杆菌转化及菌落PCR鉴定阳性克隆

1．13 测序

1．14 大肠杆菌质粒提取

1．15 农杆菌转化转化法转化农杆菌EHA105及菌落PCR鉴定阳性克隆

1．16 病毒介导的转基因沉默(VIGS)处理

1．17 PDS基因沉默后番茄植株

1．18 TETRASPANIN3基因沉默后番茄植株的表型观测

1．19 番茄总DNA的提取

1．20 TETRASPANIN3沉默植株抗TYLCV性能检测

2 结果与分析

2．1 阳性对照结果

2．2 定量PCR测定沉默效率

2．3 TETRASPANIN3基因沉默后番茄植株的形态

2．4 TETRASPANIN3基因沉默后番茄植株抗病病力检测结果

3 讨论

第四章 TETRASPANIN3基因过量表达对烟草抗病性的影响

1 材料与方法

1．1 受体材料

1．2 菌种及载体

1．3 TETRASPANIN基因克隆

1．4 TETRASPANIN基因片段PCR产物的纯化

1．5 TETRASPANIN基因片段PCR产物加A反应

1．6 TETRASPANIN基因片段加A产物与T载体的连接

1．7 TETRASPANIN基因片段加A产物与T载体连接后产物转化大肠杆菌

1．8 菌液PCR鉴定

1．9 阳性克隆质粒DNA的序列测定

1．10 TETRASPANIN3基因植物表达载体的构建

1．11 重组质粒的农杆菌转化

1．12 农杆菌菌落PCR鉴定

1．13 烟草的转化

1．14 转基因烟草的分子鉴定

1．15 转基因植株的抗病性分析

2 结果与分析

2．1 烟草植株再生

2．2 再生烟草PCR鉴定

2．3 T0代转基因烟草的筛选

2．4 T1代转基因烟草RT-PCR鉴定

2．5 转基因植株的抗病性分析

3 讨论

全文结论

参考文献

硕士期间发表的学术论文

致谢