母猪妊娠期日粮添加甜菜碱对新生仔猪肝脏糖脂代谢的影响及其表遗传机制

摘要

肝脏是机体能量代谢的中心，尤其在新生期，是糖、脂、蛋白质代谢的主要场所，在机体代谢平衡过程中起到至关重要的作用。研究表明，母体妊娠期营养通过表观遗传学机制调控新生子代肝脏中各种代谢通路。DNA与蛋白质的甲基化反应是表观遗传学重要的调节机制之一，甲基供体通过控制甲基化反应的程度从而参与表遗传调控，暗示其在母体营养程序化过程中的重要功能。甜菜碱是一种重要的甲基供体，作为蛋氨酸代谢的底物，通过蛋氨酸代谢循环为机体大部分的甲基化反应供应甲基基团。另外，甜菜碱对动物的生长发育以及糖脂代谢也起到重要的影响，但其机制仍不清楚。甜菜碱作为甲基供体营养在动物妊娠期饲料添加时对子代糖脂代谢程序化的影响及其潜在的机制目前尚未报道。由于新生儿的代谢紊乱常常伴随着成年期慢性代谢性疾病的发生，从而危害动物的健康;尤其在畜禽业，不仅影响了畜禽产品的品质，而且会引起畜禽其他疾病的发生，增加了畜禽的死亡率。因此，本研究的目的是阐述妊娠母猪日粮中甜菜碱的添加对新生仔猪肝脏糖脂代谢的影响，并揭示其表遗传机制，为畜禽健康生长以及疾病防治提供重要的理论依据。
　　1.母猪妊娠期日粮添加甜菜碱对新生仔猪肝脏甜菜碱代谢的影响
　　16头二胎长·大二元母猪，在其发情后，用两头杜洛克种公猪的混合精液进行人工授精;一周后，随机分为对照组(Con)和甜菜碱组(Bet)，每组8头母猪，对照组在母猪整个妊娠期饲喂基础日粮，而甜菜碱组在基础日粮中添加0.3％的甜菜碱。每天三个时间点进行饲喂，分别为上午5:00、10:00和下午5:00，自由饮水。妊娠母猪采取自然分娩，对出生仔猪进行称重;分娩结束后，立即从每窝新生仔猪中选取接近平均体重水平的雄性仔猪1头，心脏采血后半个小时内采集血清和肝脏组织，液氮速冻后转入-80℃低温冰箱储存。
　　母猪妊娠期日粮添加甜菜碱显著升高了新生仔猪血清中甜菜碱（P＜0.05）、蛋氨酸（P＜0.05）以及S腺苷甲硫氨酸(SAM)(P＜0.05)的浓度，血清中SAM∶SAH的比值较对照组仔猪也显著升高(P＜0.05)。同时，显著降低了新生仔猪血清同型半胱氨酸(Hcy)(P＜0.05)的浓度，但对血清中S腺苷同型半胱氨酸(SAH)的浓度没有显著影响。此外，甜菜碱组新生仔猪肝脏中甜菜碱、SAM的含量以及SAM∶SAH的比值较对照组仔猪肝脏也显著升高(P＜0.05)。
　　本实验用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测肝脏蛋氨酸代谢相关基因和蛋白的表达，结果表明:甜菜碱仔猪肝脏中甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)、甲硫氨酸腺苷基转移酶(MAT2B)、甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)和S-腺苷高半胱氨酸水解酶样因子1(AHCYL1)在翻译水平均都显著上调(P＜0.05)，同时，BHMT、GNMT和AHCYL1在转录水平也显著上调（P＜0.05）。以上结果表明，母猪妊娠期日粮添加甜菜碱增强了新生仔猪肝脏蛋氨酸代谢。
　　2.母猪妊娠期日粮添加甜菜碱对新生仔猪肝脏糖异生的影响
　　母猪妊娠期日粮添加甜菜碱显著增加新生仔猪肝糖原含量（P＜0.05），同时，显著增加血清中生糖氨基酸包括丝氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、组氨酸、精氨酸以及乳酸浓度(P＜0.05)以及肝脏中胞质型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK1)的酶活(P＜0.05)。通过实时荧光定量PCR和Western blot分析，表明甜菜碱组新生仔猪的肝脏糖异生相关基因如线粒体型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK2)和果糖-1，6-2磷酸果糖酶(FBP1)在基因水平上显著上升(P＜0.05)，在蛋白水平丙酮酸羧化酶(PC)、PEPCK1、PEPCK2和FBP1的表达都显著上调(P＜0.05)。用甲基化免疫共沉淀(MeDIP)和染色质免疫共沉淀(ChIP)分析表明PEPCK1，PEPCK2和FBP1基因启动子甲基化以及组蛋白修饰的改变(P＜0.05)分别与相对应基因的mRNA表达水平呈反向一致。此外，由于PC和PEPCK1这两个基因的表达在转录和翻译水平上的不一致，可能是由于转录后调控引起，因此，本实验对靶向这两个基因的miRNAs表达进行分析。结果表明甜菜碱新生仔猪肝脏中预测靶向PC的2个miRNA(miRNA-184(P＜0.01)和miRNA-196b(P＜0.01））以及预测靶向PEPCK1的6个miRNA，miRNA-1403p(P＜0.01), miRNA-424-3p(P＜0.01), miRNA-196b(P＜0.01),miRNA-370(P＜0.01)，miRNA-30b-3p(P＜0.05)和miRNA-92b-5p(P＜0.05)的表达均被显著抑制，这与PC和PEPCK1蛋白翻译升高相一致。结论:本研究结果表明母猪妊娠期日粮添加甜菜碱通过表遗传调控影响新生仔猪肝脏中的糖异生。
　　3.母猪妊娠期日粮添加甜菜碱对新生仔猪肝脏脂肪酸合成的影响
　　母猪妊娠期日粮添加甜菜碱显著降低新生仔猪肝脏中甘油三酯含量(P＜0.05)以及脂肪酸合成基因包括乙酰辅酶a羧化酶(ACC)（P＜0.05）、脂肪酸合成酶(FAS)（P＜0.05）、硬脂酰辅酶a去饱和酶(SCD)(P＜0.05)与这些基因的主要调节因子固醇调节元件结合蛋白1C(SREBP1C)(P＜0.05)的表达。MeDIP和ChIP分析表明甜菜碱仔猪肝脏中FAS和SCD基因启动子甲基化程度和SCD启动子上H3K27me3的结合都显著升高(P＜0.05)，并伴随着相对应的mRNA表达水平下降。我们预测SCD基因启动子上有糖皮质激素受体(GR)的结合位点，ChIP分析表明甜菜碱仔猪肝脏GR结合SCD启动子含量显著下降(P＜0.05)，而且GR蛋白表达与血清中皮质醇激素水平也显著下降(P＜0.05)。为了进一步验证GR调节SCD基因的表达，我们在肝脏细胞HepG2瞬时转染含有猪SCD启动子基因的荧光素酶报告基因质粒，然后用GR的激动剂地塞米松处理细胞，检测荧光素酶活性，发现SCD荧光素酶活性显著升高(P＜0.05)。然而对SCD启动子上GR结合位点进行缺失突变后，地塞米松升高相应的SCD启动子荧光素酶活性显著下降(P＜0.05)。此外，甜菜碱新生仔猪肝脏中靶向ACC的miRNA-1285和靶向SCD的miRNA-let-7e表达的改变与相应的蛋白水平呈反向一致。以上结果表明:母猪妊娠期日粮添加甜菜碱通过表遗传调控和GR调节机制抑制新生仔猪肝脏脂肪酸合成基因的表达。
　　4.母猪妊娠期日粮添加甜菜碱对新生仔猪肝脏胆固醇代谢的影响
　　母猪妊娠期日粮添加甜菜碱显著增加新生仔猪肝脏中的胆固醇含量（P＜0.05），并对胆固醇代谢相关基因进行调节。胆固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)以及低密度脂蛋白受体(LDLR)在mRNA和蛋白水平均被显著下调(P＜0.05)。然而，羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)在转录水平显著下降(P＜0.05)，但在翻译水平却显著上升（P＜0.05）。另外，胆固醇7α-羟化酶(CYP7a1)的表达仅在转录水平被激活（P＜0.05），而胆固醇27α-羟化酶(CYP27a1)的表达则在mRNA和蛋白水平都显著上调(P＜0.05)。用甲基化和染色质免疫共沉淀分析表:LDLR和HMGCR基因启动子甲基化水平以及抑制性组蛋白标记(H3K27me3)表达的升高(P＜0.05)与相对应的mRNA表达水平下降呈反向一致。最后，本实验对靶向这两个基因的miRNAs表达进行分析，结果表明甜菜碱新生仔猪肝脏中靶向HMGCR的miRNA-497和靶向CYP7a1的miRNA-497表达的改变与相应的蛋白水平呈反向一致。结论:母体妊娠期日粮添加甜菜碱通过表遗传机制调节新生仔猪肝脏胆固醇代谢基因的表达。

目录

声明

摘要

缩略语

引言

第一章 甜菜碱的生理功能及其在畜牧生产中的应用

1 甜菜碱的生物学特性与代谢途径

1．1 甜菜碱的理化性质与自然界分布

1．2 甜菜碱参与蛋氨酸代谢对甲基化反应的重要作用

2 甜菜碱的生理功能

2．1 甜菜碱对胎儿发育的重要作用

2．2 甜菜碱对糖脂代谢的影响

2．3 甜菜碱的渗透保护作用

3 甜菜碱在动物生产中应用的研究进展

3．1 甜菜碱在猪生产中的应用

3．2 甜菜碱在家禽生产中的应用

3．3 甜菜碱在反刍动物生产中的应用

第二章 肝脏糖脂代谢与调控

1 肝脏糖异生途径与调控

1．1 肝脏糖异生途径

1．2 肝脏糖异生调控因素

2 肝脏脂肪酸合成途径与调控

2．1 肝脏脂肪酸合成途径

2．2 肝脏脂肪酸合成的调节因素

3 肝脏胆固醇代谢的途径和调控

3．1 肝脏胆固醇代谢的途径

3．2 胆固醇代谢的调控因素

第三章 糖脂代谢程序化

1 动物胎儿期与新生期的糖脂代谢

1．1 新生动物的糖代谢

1．2 胎儿与新生儿的脂肪酸代谢

1．3 胎儿与新生儿的胆固醇代谢

2 代谢程序化的表遗传机制

2．1 DNA甲基化

2．2 组蛋白修饰

2．3 小非编码RNA

3 母体营养对子代糖脂代谢的程序化影响

第四章 母猪妊娠期日粮添加甜菜碱对新生仔猪肝脏甜菜碱代谢相关通路的影响

1 材料与方法

1．1 试验动物及处理

1．2 试验样品采集

1．3 主要试剂和仪器

1．4 主要溶液

1．5 血清和肝脏中甜菜碱的检测

1．6 血清和肝脏中SAM和SAH的检测

1．7 血清中游离氨基酸的检测

1．8 血清中激素和代谢指标的检测

1．9 新生仔猪肝脏糖异生关键基因表达检测

1．10 数据分析及统计

2 结果与分析

2．1 甜菜碱对母猪繁殖性能的影响

2．2 新生仔猪表观指标

2．3 新生仔猪血清中氨基酸水平

2．4 新生仔猪血清中激素水平

2．5 新生仔猪血清中的代谢指标

2．6 新生仔猪血清与肝脏中甜菜碱代谢的变化

2．7 新生仔猪肝脏中甜菜碱代谢基因表达

2．8 新生仔猪肝脏中甲基化转移酶相关基因表达

3 讨论

第五章 母猪妊娠期日粮添加甜菜碱对新生仔猪肝脏糖异生的影响及其表遗传机制

1 材料与方法

1．1 主要试剂和仪器

1．2 主要溶液

1．3 新生仔猪肝脏中肝糖原含量及PEPCK酶活性的测定

1．4 新生仔猪肝脏糖异生关键基因检测

1．5 蛋白质免疫印迹

1．6 MeDIP分析糖异生相关基因启动子甲基化水平

1．7 ChIP分析糖异生相关基因启动子组蛋白修饰

1．8 靶向糖异生相关基因3’UTR的miRNAs表达

1．9 统计与分析

2 结果与分析

2．1 母猪甜菜碱摄入显著升高新生仔猪肝糖原含量

2．2 新生仔猪肝脏中糖异生关键酶PEPCKl酶活性

2．3 新生仔猪肝脏糖异生相关基因的表达

2．4 新生仔猪肝脏糖异生相关基因启动子甲基化和组蛋白修饰

2．5 新生仔猪肝脏糖异生相关基因转录后修饰

3 讨论

第六章 母猪妊娠期日粮添加甜菜碱对新生仔猪肝脏脂肪酸合成的影响及其机制

1 材料与方法

1．1 主要试剂和仪器

1．2 主要溶液

1．3 肝脏组织甘油三酯的检测

1．4 肝脏脂肪酸合成相关基因mRNA表达

1．5 蛋白质印迹

1．6 甲基化免疫共沉淀

1．7 染色质免疫共沉淀

1．8 靶向脂肪酸合成基因的miRNAs的表达

1．9 靶向脂肪酸合成基因的miRNAs体外验证

1．10 BSP基因甲基化检测

1．11 体外验证GR对SCD的调节作用

2 结果与分析

2．1 新生仔猪肝脏中甘油三酯含量

2．2 新生仔猪肝脏中脂肪酸合成相关基因的表达

2．3 新生仔猪肝脏中GR的表达

2．4 脂肪酸合成相关基因的表遗传和GR的调控

2．5 SCD基因启动子的BSP分析

2．6 体外验证GR对SCD的调节作用

2．7 靶向ACC、SCD和GR基因的miRNAs的表达

3 讨论

第七章 母猪妊娠期日粮添加甜菜碱对新生仔猪肝脏胆固醇代谢的影响及其机制

1 材料与方法

1．1 主要试剂和仪器

1．2 主要溶液

1．3 肝脏组织总胆固醇和胆汁酸含量的检测

1．4 胆固醇代谢基因mRNA表达

1．5 胆固醇代谢相关基因的蛋白表达

1．6 DNA甲基化免疫共沉淀检测

1．7 组蛋白染色质免疫共沉淀

1．8 靶向性miRNAs表达

1．9 miRNAs体外功能验证

2 结果与分析

2．1 新生仔猪肝脏n_a固醇和胆汁酸的含量

2．2 新生仔猪肝脏中胆固醇代谢相关基因的表达

2．3 HMGCR和LDLR基因的DNA甲基化和组蛋白修饰

2．4 新生仔猪肝脏胆固醇代谢相关基因的转录后调控

2．5 体外验证靶向于HMGCR和CYP7a1的miRNAs

3 讨论

总体讨论

本文结论

本文创新点

致谢

参考文献

攻读博士期间发表文章情况