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杀虫剂处理对甜菜夜蛾尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因表达的影响

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摘要

第一章 文献综述

1.1 害虫抗药性机制

1.1.1 表皮穿透速率降低

1.1.2 靶标位点敏感度降低

1.1.3 代谢解毒能力增强

1.2 解毒代谢机制

1.2.1 细胞色素P450

1.2.2 酯酶

1.2.3 谷胱甘肽S-转移酶

1.3 UGT的研究进展

1.3.1 UGTs基因

1.3.2 UGTs的命名

1.3.3 UDP-葡萄糖糖基化反应

1.3.4 哺乳动物UDP-糖基转移酶

1.3.5 植物UDP-糖基转移酶

1.3.6 昆虫UDP-糖基转移酶

1.4.1 甜菜夜蛾的分布与危害

1.4.2 甜菜夜蛾的抗药性现状

1.5 本研究的目的与意义

第二章 甜菜夜蛾UGTs家族基因的克隆

2.1.1 供试昆虫

2.1.2 主要仪器

2.1.3 主要试剂

2.1.4 引物设计

2.1.5 总RNA提取以及反转录反应

2.1.6 5’-RACE和3’-RACE cDNA的合成

2.1.7 PCR扩增目的片段

2.1.8 PCR产物回收

2.1.9 目标基因片段的连接

2.1.10 目的基因连接产物转化反应以及阳性克隆鉴定

2.1.11 目的基因序列鉴定

2.1.12 UGT基因的命名

2.1.13 系统进化分析

2.2 结果与分析

2.2.1 甜菜夜蛾UGTs基因的特征

2.2.2 甜菜夜蛾UGT基因的系统进化分析

2.3 讨论

第三章 杀虫剂处理对UGT表达的影响

3.1 材料与方法

3.1.1 主要仪器

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要试剂的配制

3.1.4.甜菜夜蛾脂肪体细胞培养方法

3.1.5 杀虫剂处理细胞

3.1.6 UGT表达水平分析

3.2 结果分析

3.3 讨论

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全文总结

参考文献

致谢

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摘要

随着甜菜夜蛾抗药性的问题日趋严重,并且对农业生产上造成的影响越来越严重,需要进一步对昆虫的抗性机制进行更加深入的了解,同时理解害虫抗药性的作用机制也是我们制定害虫综合防治策略的前提。害虫体内的解毒代谢酶在害虫抗药性的发展历程中扮演着不可替代的角色,已经有大量报道发现,包括细胞色素P450酶、酯酶及谷胱甘肽S-转移酶等多种解毒代谢酶介导的杀虫剂代谢解毒作用的增强是害虫抗药性产生的主要机制。UGT在哺乳动物解毒代谢中起到非常重要的作用,但昆虫UGT是否参与对杀虫剂的解毒代谢,并导致抗药性,目前尚未见研究报道。本研究首次对甜菜夜蛾UGT基因开展系统的分析,从而为研究甜菜夜蛾对杀虫剂产生抗药性的分子机制提供新的依据。
  1.甜菜夜蛾UGT基因的克隆与特征
  首次报道甜菜夜蛾幼虫表达的32个UGT基因,得到的所有甜菜夜蛾UGTs氨基酸序列都包含UGT特征结构:(FVA)-(LIVMF)-(TS)-(HQ)-(SGAC)-G-X(2)-(STG)-X(2)-(DE)-X(6)-P-(LIVMFA)-(LIVMFA)-X(2)-P-(LMVFIQ)-X(2)-(DE)-Q(括号中列举的是必需氨基酸所在的位置,X代表可以是任意氨基酸)。虽然这些UGTs的N末端显示出较少的氨基酸保守性,但是所有的N末端都包含一个将该蛋白引导进入内质网的信号肽,同时C末端具有一个锚定UGT蛋白于内质网膜上的亲水跨膜区域。所有的甜菜夜蛾的UGTs蛋白序列与鳞翅目的其它种类昆虫具有较高的氨基酸同源性。
  2.甜菜夜蛾UGT基因系统进化分析
  利用鳞翅目家蚕的42个UGTs和棉铃虫的40个UGTs与克隆的32个全新的甜菜夜蛾UGTs一起构建进化树。发现UGT基因显示出较高的种间保守性,同时甜菜夜蛾的UGT基因与家蚕和棉铃虫UGTs具有较高的同源性并且系统进化方面也具有较高的相似性。所有的32个甜菜夜蛾UGTs分别从属于9个不同的UGT家族。UGT33B14,UGT33B15, UGT33B16, UGT33F5, UGT33F6, UGT33F7, UGT33F8, UGT33J3,UGT33T3,UGT33V1,UGT33V2,UGT33V3,UGT33V4共13个UGT基因组成了是甜菜夜蛾UGT家族中最大的UGT33家族。第二大家族是UGT40包含11个UGT基因,分别是UGT40D3, UGT40D5, UGT40F3, UGT40F4, UGT40F5, UGT40L3, UGT40M2,UGT40M3,UGT40Q2,UGT40R4,UGT40U2。剩余的的甜菜夜蛾UGT基因分别属于只包含一到两个基因的小家族。
  3.杀虫剂处理对UGT表达的影响
  脂肪体细胞被杀虫剂处理后,UGT基因的表达会迅速作出响应,比较茚虫威、氰氟虫腙、氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯以及阿维菌素5种杀虫剂处理后,UGT基因表达水平的变化差异。在所有分析的32个UGT基因中仅有UGT33T3与UGT40D5在5种药剂处理后都表达水平显著上调,而UGT33V1表达水平显著下调。茚虫威、氰氟虫腙、氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯4种药剂处理脂肪体细胞后,其UGT基因表达变化相似度非常高,其中UGT33T3、UGT33J3、UGT40D5以及UGT42B5在这4种药剂处理后其表达水平都显著上调,同时UGT33V1表达水平显著下调。而阿维菌素处理后的脂肪体UGT基因表达水平的变化与以上4种药剂有很大差异,仅有UGT33T3和UGT40D5表达水平上调,大多数UGT基因的表达水平展现出不同程度的下调。
  显然脂肪体细胞对阿维菌素以及其它4种杀虫剂在UGT表达响应方面差异很大,意味着脂肪体细胞对阿维菌素和其它4种药剂解毒代谢方式的不同,而其它4种杀虫剂的解毒代谢方式可能有许多共同之处。

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