‘滁菊’病毒脱除及脱毒苗活性成分含量分析

摘要

‘滁菊’(Chrysanthemum morifolium(Ramat.)Tzvel.‘Chuju’）是菊科菊属多年生的草本植物。因其独特而良好的养生及药用功效，名列中国四大药菊之首，还是安徽省“四大”著名药材之首。近年来，‘滁菊’在我国的栽培面积逐步扩大，但由于在数百年的栽培过程中，长期营养繁殖导致其病毒感染较严重，出现种质退化，花变异发红，花朵品质变差等现象，严重阻碍和制约了‘滁菊’产业化的发展。本文从‘滁菊’的病毒检测开始，确定感染病毒种类，比较了3种主要脱毒方法对‘滁菊’病毒脱除的效果，并对脱毒植株的遗传稳定性和叶片活性成分含量进行了评价，建立了‘滁菊’病毒检测和高效脱毒的技术体系，为‘滁菊’脱毒苗的推广和应用提供了有力的理论依据。主要研究结果如下:
　　1.以田间表现出症状，疑似感染病毒的‘滁菊’为材料，通过电镜检测和巢式RT-PCR两种方法检测侵染‘滁菊’的主要病毒，最终病毒检测结果表明:侵染‘滁菊’的主要病毒为菊花B病毒(CVB)和菊花矮化类病毒(CSVd);建立了以巢式RT-PCR为基础，以CVB病毒的5'序列反向引物为特异引物进行反转录得到特异cDNA的高灵敏度检测菊花B病毒体系，其灵敏度高达10-9，有效地解决了现有病毒检测技术中对菊花B病毒的检测灵敏度不高，易出现假阳性等问题，为田间早期的菊花病毒病防控提供了有效的帮助。
　　2.进一步通过茎尖分生组织培养、热处理结合茎尖分生组织培养及化学试剂病毒唑结合茎尖分生组织培养3种脱毒方法对‘滁菊’病毒进行脱除，比较了3种脱毒方法的‘滁菊’茎尖存活率和脱毒效果。结果表明:一次茎尖分生组织培养的存活率最高，为78.78％;病毒唑添加浓度为10 mg/mL时茎尖存活率较高;热处理结合茎尖分生组织培养和化学试剂结合茎尖分生组织培养脱毒效果较单独采用茎尖分生组织培养的脱毒效果好。
　　3.在DNA水平上，利用12对SRAP引物组合对3种不同脱毒方法获得的脱毒苗以及常规无菌组培苗进行遗传稳定性分子检测，结果表明3种不同脱毒方法获得的脱毒苗与常规无菌苗之间未检测到遗传位点的明显差异，表明了脱毒处理及再生培养没有对‘滁菊’产生了遗传变异影响，3种脱毒方法获得的脱毒苗均能有效地保持‘滁菊’的遗传稳定性;利用液相色谱检测比较了3种不同脱毒方法的脱毒苗及无菌苗、大田苗叶片中总黄酮、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A的含量，结果表明脱毒苗与常规无菌苗、大田苗之间有明显差异，热处理结合茎尖分生组织培养的脱毒苗与大田苗差异极显著，分别比大田苗增加了1.93，4.46，2.02，14.58倍。

目录

声明

摘要

缩略词表

引言

第一章 文献综述

1 ‘滁菊’简介

1．1 ‘滁菊’的由来

1．3 ‘滁菊’的生产现状

2 植物病毒侵染机制及病毒病的症状

3 植物病毒的检测方法

3．1 生物学植物病毒检测方法

3．2 电镜观察检测法

3．4 分子生物学检测方法

4 植物脱毒方法的研究进展

4．1 药物喷施

4．2 抗病毒基因工程

4．3 植物组织培养脱毒方法

5 脱毒对生理代谢的影响

6 菊科植物主要病毒

6．1 菊花B病毒(Chrysanthemum virus B，CVB)

6．2 番茄不孕病毒病(Tomato aspermy virus，TAV)

6．4 马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)

6．8 菊花褪绿斑驳类病毒(Chrysanthemum Chlorotic Mottle viroid，CChmvd)

7 菊花的脱毒研究

8 本研究的目的意义

第二章 ‘滁菊’的病毒检测

1 材料

2 实验方法

2．1 材料采集与记录

2．2 ‘滁菊’病毒电镜诊断

2．3 巢式RT-PCR病毒检测

2．4 高灵敏度菊花B病毒检测体系的建立

2．5 疑似菊花B病毒样品的实际检测

3 结果与分析

3．1 ‘滁菊’病毒病统计观察

3．2 ‘滁菊’病毒电镜观察检测

3．3 巢式RT-PCR检测结果

3．4 高灵敏度菊花B病毒检测体系的建立

3．5 高灵敏度菊花B病毒检测体系田间应用

4 讨论

第三章 ‘滁菊’脱毒方法的研究

1 材料

2 实验方法

2．1 ‘滁菊’无菌苗再生体系的建立

2．2 茎尖培养适宜培养基的筛选

2．3 茎尖分生组织培养法

2．4 热处理结合茎尖分生组织培养法

2．5 化学试剂结合茎尖分生组织培养法

2．6 脱毒苗脱毒效果检测及扩繁和生根

2．7 脱毒苗移栽

2．8 数据统计与分析

3 结果与分析

3．1 ‘滁菊’茎尖分生组织培养适宜培养条件的确定

3．2 化学试剂结合茎尖分生组织培养法诱导成活率

3．3 3种不同脱毒方法的茎尖存活率比较

3．4 3种脱毒方法脱毒效果的检测与比较

3．5 ‘滁菊’脱毒苗的增殖和生根

3．6 3种脱毒苗炼苗移栽

4 讨论

第四章 ‘滁菊’脱毒苗遗传稳定性和活性成分含量鉴定

1 材料

2 方法

2．1 脱毒苗遗传稳定性分析

2．2 ‘滁菊’叶片活性成分含量分析

2．3 数据统计与分析

3 结果与分析

3．1 ‘滁菊’遗传稳定性分析

3．2 脱毒苗‘滁菊’叶片活性成分含量分析

4 讨论

全文结论

创新之处

参考文献

附录

攻读学位期间发表论文、申请专利

致谢