基于RNA-Seq研究外界环境及化学物质对红叶桃离体叶片花色苷生物合成的作用

摘要

桃（Prunus persica），原产于中国，蔷薇科李属重要果树。食用桃是我们桃产业的发展主体，类型与品种都很丰富。除食用桃外，观赏桃也是桃资源重要的一部分。红叶桃（Prunus persica f.atropurpurea）作为观赏桃在园林应用广泛，且因春季叶色鲜红，夏季返青，秋季又暗红的特点而成为研究热点。本实验室生理研究发现，红叶桃、紫叶李等观叶树种叶色呈现是花色苷积累造成的，而花色苷种类在叶片变色前后期没有变化。大量研究也表明，外界环境，化学物质及植物内、外源激素等在调控花色苷的生物合成过程中也具有十分重要的作用。为了进一步研究红叶桃变色机理，本研究以红叶桃‘筑波5号’为试验材料，首先利用转录组测序技术，对三个季节（春、夏、秋）叶片进行了差异基因分析，然后通过环境、化学物质及激素等处理9月份离体叶片，荧光定量表达分析花色苷合成过程中的结构基因（CHI、UFGT）和调控基因(MYB10、MYB15、bHLH33及WD40)的表达水平。主要研究结果如下:
　　1.本试验使用转录组测序技术，获得了含有完整编码区序列信息的基因有27865个，其中5467个基因在桃基因测序和注释中未被发现，属于新发现的基因。5月份叶片与7月份叶片对比分析，得到2738个差异表达基因;5月与9月对比分析，得到2419个差异表达基因;7月份与9月份对比分析发现了1540个差异表达基因。GO功能分析表明，差异基因主要涉及细胞、细胞器、细胞代谢、催化活性、细胞生理进程及结合等方面。KEGG注释分析显示，碳水化合物代谢、脂类代谢及其他次生代谢产物的生物合成中涉及的差异表达基因频率较高。测序结果还发现，与温度、光照、生长素、脱落酸、乙烯、茉莉酸和水杨酸等相关的基因在不同叶片生长时期表达差异显著，推测与叶片花色苷合成及调控具有一定联系。分析发现结构基因UFGT(ppa005162m)、CHI(ppa011476m)及MYB区域蛋白4(ppa010227m)可能在桃叶色花色苷合成中具有促进作用。
　　2.根据RNA-Seq研究结果，以‘筑波5号’红叶桃9月份的离体叶片为试材，利用QRT-PCR技术分析温度、光照时长及激素处理对叶片中花色苷生物合成途经中CHI、UFGT基因表达水平的影响。结果显示:低温促进CHI基因的表达，而抑制UFGT基因的转录，与高温相反。光照促进CHI、UFGT基因的表达;光照均能促进CHI、UFGT的表达;激素处理（ABA、IAA、JA及SA）均能在一定浓度、时间进程内促进CHI和UFGT基因的表达，但是两个基因对各激素的敏感度不同:ABA三个浓度处理叶片均能提高CHI基因的表达，且随着处理时间的延长作用效果越好，而UFGT在50μM和100μM浓度下促进表达，150μM浓度过高表达受抑制;50μM低浓度IAA处理能显著促进CHI及UFGT基因的表达，100μM和150μM高浓度是抑制CHI和UFGT表达的因素;100μM浓度JA均能促进两个基因的表达;三个SA浓度中，CHI最适合的浓度为50μM，而UFGT最适浓度为100μM。
　　3.以‘筑波5号’红叶桃离体叶片为试材，利用QRT-PCR技术分析不同浓度蔗糖、NaCl及KH2PO4处理对叶片中花色苷生物合成途经结构基因（CHI、UFGT）和调控基因（MYB10、MYB15、bHLH33及WD40）表达水平的影响。结果显示:低浓度(100和200 mM)，短时间(4 h)NaCl处理均能提高CHI、UFGT、MYB10、bHLH33基因的表达水平;0.3％，8h的蔗糖处理对UFGT、MYB10、bHLH33基因的表达促进作用显著;0.2％，8h的KH2PO4处理对除了MYB15之外的基因表达也具有显著的促进作用。而且CHI基因的表达，在一定范围内，随蔗糖及KH2PO4浓度的增高，处理时间的延长，效果更明显。3种外源物质对MYB15、WD40的表达均具有显著抑制作用，但0.2％，8h的KH2PO4处理提高了WD40的转录。

目录

声明

摘要

缩略词(Abbreviations)

引言

第一部分 文献综述

1 转录组测序

1．1 测序技术的发展

1．2 RNA-Seq测序技术

1．3 RNA-Seq技术的优势与应用

1．4 RNA-Seq技术在果树学中的应用

2 花色苷的生物合成

2．1 结构基因

2．2 调控基因

3 环境对花青苷合成基因的影响

第二部分 研究报告

第一章 基于RNA-Seq的红叶桃叶色变化的转录组分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 结论

参考文献

第二章 温度、光照及激素处理对离体红叶桃叶片CHI及UFGT基因表达的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第三章NaCl、蔗糖及KH2PO4处理对离体红叶桃叶片花色苷合成相关基因表达的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第三部分 全文结论与主要创新点

(一)主要结论

(二)主要创新点

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