淹水条件下水稻土中砷氧化菌对砷形态的影响及机制研究

摘要

砷(As)是一种有剧毒的类金属。目前，随着我国工业的快速发展，环境中砷污染愈来愈严重。污染土壤中较高浓度的砷会对植物产生毒害效应，危害其生长发育，并降低农作物产量和品质。由于水稻的种植方式以及其对As(Ⅲ)的高效吸收，通常会比其他粮食作物富集更高含量的砷。稻米已经成为水稻生产和消费地区，特别是东南亚以及中国的南方水稻种植地区，最为主要的砷的食物暴露途径。依赖于硝酸盐还原的厌氧砷氧化菌通过与硝酸盐还原过程耦合将As(Ⅲ)氧化为As(Ⅴ)，As(Ⅴ)在土壤中的移动性和生物毒性相对于As(Ⅲ)都有所下降。本研究旨在探索砷氧化菌耦合As(Ⅲ)氧化与硝酸盐还原过程，将砷氧化菌接种到淹水砷污染土壤中，观察其对土壤中砷形态和总量的影响，并从不同砷污染土壤中分离筛选依赖于硝酸盐还原的砷氧化菌，研究其生理生化特征和砷氧化特性，加强砷氧化菌耦合As(Ⅲ)氧化与硝酸盐还原过程的机制研究，并探究硝酸盐的添加对土壤砷形态转化的影响，建立克隆文库和构建系统发育树分析。具体研究内容和结果如下:
　　(1)利用实验室保藏的砷氧化菌SY，对其进行As(Ⅲ)氧化特性研究，发现SY可以以As(Ⅲ)为电子供体，NO3-为电子受体，偶联As(Ⅲ)氧化与反硝化过程，并从中获得能量用于生长。我们从SY的基因组DNA中扩增出砷氧化酶基因、二氧化碳固定酶基因和反硝化酶基因簇。通过构建aioA基因的敲除突变株SY△aioA，发现aioA基因的缺失导致SY△aioA完全丧失了As(Ⅲ)氧化能力并对As(Ⅲ)表现得更为敏感。为了验证菌株SY在淹水土壤中是否具有As(Ⅲ)氧化能力，我们将菌株SY接种到砷污染土壤中，结果表明土壤孔隙水和土壤底泥中的As(Ⅲ)比例下降，As(Ⅴ)比例上升，总砷含量均低于对照处理，可以推测菌株SY参与了淹水土壤中的厌氧As(Ⅲ)氧化过程。然后通过建立上虞砷污染水稻土aioA基因的克隆文库，并构建aioA基因系统发育树进行分析，发现与SY类似的砷氧化菌在上虞土壤中广泛存在，推测此类砷氧化菌在上虞砷污染水稻土中的砷氧化还原过程中扮演不可或缺的角色。
　　(2)通过对不同砷污染土壤进行砷氧化菌的筛选，共计分离出6株具有砷氧化能力的菌株，其中4株扩增出砷氧化酶基因(aioA)，主要包括根瘤菌属(Rhizobium)、包西氏菌属(Bosea)和剑菌属(Ensifer)等。然后对其生理生化特征和砷氧化特性进行研究，挑选厌氧反硝化条件下具有As(Ⅲ)氧化能力的菌株进一步进行分析，强化厌氧反硝化条件下As(Ⅲ)氧化的微生物作用机制。
　　(3)进行土壤淹水培养试验，将硝酸盐加入到砷污染水稻土中，观察其对土壤砷形态转化的影响。硝酸盐加入到淹水土壤后，土壤溶液中大部分的As(Ⅲ)被氧化成As(Ⅴ)，土壤孔隙水中总砷的含量也得到了降低。从砷氧化酶基因（aioA）定量的结果来看，aioA基因的丰度得到了提高，通过建立aioA基因克隆文库，构建系统发育树进行分析，发现在3mM硝酸盐添加的情况下，Acidovorax相关的OTU得到了大幅度增加，说明硝酸盐还原过程刺激了该类砷氧化菌的增殖。
　　在淹水土壤中，砷的转化虽然以还原反应为主，但微生物的厌氧砷氧化过程却不容忽视，在某些特定的条件下，加强这类微生物在厌氧条件下的As(Ⅲ)的氧化过程或刺激此类微生物的生长，也许可以对土壤中的砷进行有效的调控，降低砷的移动性和生物有效性，减少植物对砷的积累。本研究对依赖于硝酸盐还原进行厌氧As(Ⅲ)氧化的微生物有一个初步的认识，并揭示了此类微生物在厌氧反硝化条件下的砷氧化机制，为控制土壤中砷的生物有效性和减少植物对砷的积累提供了重要的理论依据和指导意义。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 砷的来源和污染

1．1 砷的来源

1．2 砷的污染

2 砷的形态、毒害和迁移性

2．1 砷的形态

2．2 砷的毒性

2．3 砷的危害

2．4 砷的迁移性

3 微生物对砷的转运、解毒和修复

3．1 微生物对砷的转运

3．2 微生物对砷的修复

4 研究目的与意义

5 研究内容

6 技术路线

第二章 菌株SY的砷氧化特性研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验菌株

2．2 菌株SY的生理生化特性研究

2．3 aioA基因克隆文库的建立

2．4 aioA基因的系统发育树分析

3 结果与分析

3．1 菌株SY的生理生化特性研究

3．2 aioA基因的多样性和系统发育树分析

4 讨论

5 小结

第三章 砷氧化菌的分离、鉴定与生理生化特性研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验土壤

2．2 砷氧化菌的分离和筛选

2．3 砷氧化菌的鉴定与系统发育树分析

2．4 菌株ST1和ST2的生理生化特性研究

3 结果与分析

3．1 砷氧化菌的筛选

3．2 菌株ST1和ST2的鉴定与系统发育树分析

3．3 菌株ST1和ST2的生理生化特性

4 讨论

5 小结

第四章 硝酸盐的添加对土壤砷形态转化的影响

1 前言

2．1 实验土壤

2．2 土壤基本性质

2．3 土壤淹水实验

2．4 基因的定量

2．5 aioA基因克隆文库的构建

2．6 aioA基因系统发育树分析

3 结果与分析

3．1 土壤培养实验结果与分析

3．2 基因定量的结果与分析

3．3 土壤砷氧化微生物

4 讨论

5 小结

第五章 全文总结和展望

1 全文总结

1．1 菌株SY的砷抗性和砷氧化特性

1．2 砷氧化菌的多样性

1．3 硝酸盐对微生物介导的土壤厌氧砷氧化的影响

2 研究展望

3 创新点

参考文献

附录

致谢

作者简介及在学期间发表的论文与参与项目