RNAi介导沉默棉铃虫激素相关基因的抗虫棉培育及陆地棉(Gossypium hirsutum)GhHsp20基因家族分析

摘要

棉花是世界性的重要经济作物，产生的天然纤维是重要的纺织工业原料。然而，由于环境恶化，棉花在其生长区域频繁遭受着干旱、高盐、低温等非生物以及虫害等生物胁迫的侵袭，尤其是棉铃虫(Helicoverpa armigera，CBW)。通过转基因作物表达苏云金芽孢杆菌毒素蛋白(Bt)是一种非常有效的防治害虫手段。然而，害虫抗性的产生将使之效率大大降低，有必要开发新型的抗虫棉品种。
　　本研究从棉铃虫中克隆到保幼激素甲基转移酶基因(HaJHAMT)、保幼激素结合蛋白基因(HaJHBP)及促前胸腺激素基因(HaPTTH)等3个激素相关基因，构建相应的dsRNA植物表达载体，经遗传转化获得转基因棉花。对敏感品系棉铃虫(SCD)从幼虫期到蛹期的抗虫性检测结果表明，取食转基因棉花叶片的棉铃虫表现较低的化蛹率，JHAMT株系为36.7％、JHBP1-1株系为26.0％、PTTH3-113株系为38.0％、PTTH5-23株系为47.3％，而对照组达到85.3％。除了较低的化蛹率之外，畸形率也从26.2％～53.0％不等，极显著高于转基因受体对照W0(5.9％，P＜0.01)。处理组有些幼虫在末龄期不能正常蜕皮，一些蛹也出现了蛹壳发育不全的现象。
　　dsRNA表达的单价转基因棉花对敏感品系棉铃虫表现出高的抗性水平，然而，已有研究发现田间棉铃虫对Bt已产生抗性。因此，我们进一步研究了对抗性品系棉铃虫(SCD-rl)的抗性水平。结果表明转基因株系对敏感品系和抗性品系在化蛹率、死亡率上均表现出相同的抗性水平，与Bt植株的抗性水平相比，对敏感品系棉铃虫而言，效果有较大差异，而对抗性品系棉铃虫而言，转基因株系抗性水平远高于Bt植株，表明转基因林系未来可以有效的控制抗性品系棉铃虫。
　　为了获得更高的抗性株系，我们将JHAMT，JHBP，PTTH3和PTTH5转基因棉花株系与Bt(Cry1Ac)抗虫棉杂交。对同时表达dsRNA和Bt毒素蛋白的叠加后代进行抗性品系棉铃虫的鉴定，结果表明叠加杂合体幼虫取食叠加后代棉花叶片后体重与对照相比显著降低(P＜0.01)，Bt×JHAMT叠加杂合体化蛹率为35.3％，Bt×JHBP叠加杂合体化蛹率为26.7％，Bt×PTTH3叠加杂合体化蛹率为50.7％，Bt×PTTH5叠加杂合体化蛹率为38.0％，与对照Bt(83.3％)相比显著降低，而与JHAMT，JHBP，PTTH3和PTTH5转基因亲本相比没有差异。叠加杂合体畸形率(24.0％～44.8％)与对照Bt(7.4％)相比也升高了6倍左右。同时叠加纯合体Bt×JHAMT与Bt×JHBP化蛹率分别为30.7％和24.7％，与对照Bt(83.3％)相比显著降低，而畸形率分别为47.1％和48.8％，与对照Bt(6.7％)相比大大提高。这些结果充分说明了RNAi与Bt叠加能够有效地控制棉铃虫的生长与繁殖。
　　几乎所有的敏感品系和抗性品系棉铃虫取食转基因棉花叶片后都表现出生长发育滞后现象，化蛹时间均延迟4天左右。
　　本研究开发了通过干扰昆虫激素相关基因表达的新抗虫策略，同时将RNAi介导沉默激素相关基因的转基因棉花与含Bt毒素蛋白棉花杂交得到的后代，可以作为新的一代抗虫棉具有很大的实际应用潜力，不仅可以提高抗虫效果，也可以有效延缓靶标害虫的抗性水平。
　　Hsp20基因是植物热激蛋白家族中最大的一类家族成员，它参与热激反应和多种抗逆反应，并对许多环境因子做出应答。迄今为止，对棉花Hsp基因的研究非常有限，且尚没有对Hsp20整个基因家族做出系统研究的报道。
　　本研究中，在G.hirsutum基因组中分析得到94个GhHsp20家族基因，通过进化分析分成14大类亚家族。通过分析GhHsp20基因家族在Ghirsutum基因组中的复制事件，发现存在74个片段重复基因，而串联重复基因只有14个，结果表明GhHsp20基因家族的扩增可能主要是由片段重复导致的。根据转录组数据分析发现，总共有82个基因至少在所测试的24个组织中的一个组织中表达，表明GhHsp20基因在棉花生长发育各个阶段扮演着不同的角色。对逆境胁迫下的转录组数据分析发现约2/3的基因在热胁迫下上调表达，15个基因在多种胁迫同时被诱导表达。除此之外，qRT-PCR分析验证了16个基因都被热诱导，8个基因在多重胁迫下和激素处理下上调表达。
　　综上所示，研究结果不仅对阐述GhHsp20基因家族在植物生长发育中所介导的复杂机制奠定了基础，而且对棉花非生物胁迫信号转导提供了有力的帮助。

目录

声明

摘要

本文所用主要缩略词

第一章 抗虫棉的研究与发展

1 抗虫棉研究进展

2 抗虫棉的研究方法及策略

2．1 植物诱导抗虫

2．2 利用抗虫基因防治害虫

2．3 利用昆虫激素防治害虫

2．4 利用RNA干扰技术增强作物对害虫的抗性

2．5 庇护所策略和基因聚合育种在害虫防治上的应用

3 抗虫棉的应用现状

第二章 保幼激素及促前胸腺激素研究进展

1 保幼激素

1．1 保幼激素的生理功能

1．2 保幼激素的合成与代谢

2 促前胸腺激素

2．1 促前胸腺激素的生理功能

2．2 促前胸腺激素的合成与代谢

第三章 小分子热激蛋白Hsp20基因家族研究进展

1 热激蛋白的概述

1．1 Hsp20基因家族的蛋白结构

1．2 植物Hsp20基因家族的分类

2 植物Hsp20基因家族的功能

2．1 Hsp20蛋白具有分子伴侣功能

2．2 Hsp20在植物逆境中发挥的作用

本研究的目的和意义

2 陆地棉(Gossypium hirsutum)GhHsp20基因家族分析

第四章 RNAi介导和Bt基因叠加的新型抗虫棉培育

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 受试昆虫

1．3 菌株及质粒

1．4 培养基及人工饲料的配置

1．5 农杆菌介导的棉花遗传转化

1．6 Southern杂交

1．7 Northern杂交

1．8 荧光实时定量RT-PCR分析

1．9 半定量PCR

1．10 转基因棉农艺性状调查

1．12 细菌表达dsRNA的诱导和纯化

1．13 转基因棉花的生物测定

1．14 激素的测定

1．15 叠加后代纯合体鉴定

2 结果和分析

2．1 RNAi介导沉默棉铃虫激素相关转基因棉花的培育

2．2 转基因植株的PCR检测和纯合株系的获得

2．3 转基因棉花拷贝数鉴定

2．4 转基因棉花dsRNA及siRNA的检测

2．5 转基因棉花在大田中的主要农艺性状调查

2．6 转基因棉花对棉铃虫幼虫期生长发育的影响

2．7 转基因棉花对棉铃虫蛹期生长发育的影响

2．8 转基因棉花对受试棉铃虫靶标基因mRNA水平的影响

2．9 受试棉铃虫体内激素滴度的变化

2．10 转基因棉花对受试棉铃虫激素代谢途径相关基因mRNA水平的影响

2．11 转基因棉花对斜纹夜蛾生长发育的影响

2．12 家蚕对转基因棉花的反应

2．13 RNAi与Bt叠加抗虫棉的棉铃虫抗性表现

3 讨论

3．1 表达dsRNA转基因植物的抗虫性研究

3．2 RNAi与Bt叠加新型抗虫棉有广阔的利用前景

3．3 表达dsRNA转基因植株对非靶标昆虫的影响分析

第五章 陆地棉(TM-1)GhHsp20基因家族分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 植物生长条件及处理方法

1．4 基因家族数据与分析方法

2 结果和分析

2．1 G．hirsutum中GhHsp20家族基因的鉴定

2．2 GhHsp20基因家族蛋白保守结构域分析

2．3 GhHsp20基因家族蛋白结构的分析

2．4 GhHsp20基因家族进化分析

2．5 GhHsp20基因在染色体上的分布及基因的扩增

2．6 GhHsp20基因组织表达模式分析

2．7 GhHsp20基因受逆境胁迫和激素处理的表达模式分析

3 讨论

3．1 棉花GhHsp20基因家族结构及进化特性

3．2 棉花GhHsp20基因家族表达模式

全文结论

创新点

参考文献

附录

发表论文

致谢