氮营养素调控猪肠营养吸收和黏膜屏障功能的研究

摘要

养猪业的可持续发展关乎国计民生，但蛋白质饲料资源紧缺和氮排放污染问题是制约我国养猪业可持续发展的瓶颈。在当前我国养猪生产中，为追求生长速度而盲目参考美国NRC标准使用高蛋白质水平日粮，或因优质蛋白质原料缺乏不得不使用低质蛋白质原料并通过提高蛋白质水平来满足猪对必需氨基酸的需要，造成蛋白质资源浪费。因此，在合理范围内（不影响猪生长性能）降低氮营养素是保障养猪业健康发展的重要措施。本课题主要研究适当降低日粮中粗蛋白的水平对猪胃肠道黏膜的发育和营养吸收功能的影响机制;同时基于精氨酸作为一种功能性半必需氨基酸，是构成日粮粗蛋白的一种重要元素，能够通过改善仔猪肠道黏膜健康促进仔猪发育，因此通过体外试验探索精氨酸对肠上皮细胞屏障功能和营养吸收功能的影响，为降低饲料中氮营养素提供理论基础，为生猪饲粮的配制加工提供参考依据。我们进行了如下研究:
　　试验一:针对不同阶段（45～160日龄）的生猪，分别饲喂低蛋白质组(LP)和NRC标准组(NP)的粗蛋白水平日粮，检测氮营养素对猪肠道形态和黏膜免疫功能的影响。试验结果显示，相对于NRC标准日粮组，适当降低粗蛋白水平不会影响肠绒毛（绒毛高度和隐窝深度）和杯状细胞的数目的结构(P＞0.05); LP组日粮能够维持空肠的黏蛋白MUC2和E-cadherin的表达水平(P＞0.05）。我们还发现，降低日粮粗蛋白水平不会影响45-160日龄的猪的氨基酸转运载体CAT-1和ASCT1表达(P＞0.05)，但是空肠中EAAT3、SGLT1和GLUT2表达水平在一定时期内得到显著提高(P＜0.05，P＜0.01)。研究表明LP组日粮粗蛋白水平足以维持猪肠黏膜结构、屏障功能以及营养吸收功能，这将为减少养猪业氮污染排放量、节约氮资源和制定适合我国生猪生产的日粮组成等问题提供理论基础。
　　试验二:深入研究精氨酸对肠上皮细胞IPEC-J2细胞屏障和营养吸收功能的影响。将含不同浓度（0 mM、0.2mM和0.7 mM）的精氨酸DMEM-F12培养基培养接种在Transwell小室上的IPEC-J2细胞，通过细胞的生长状况、细胞紧密连接和营养吸收调控探索精氨酸对IPEC-J2细胞的影响。研究发现:相对于正常细胞培养基中精氨酸的浓度(0.7mM)，不添加精氨酸(0mM)的培养基明显降低IPEC-J2的跨上皮电阻和Claudin-1、SGLT1、GLUT2的蛋白和Muc1 mRNA表达水平(P＜0.05，P＜0.01）;而适当降低精氨酸的浓度(0.2 mM)对肠上皮细胞跨上皮电阻和紧密连接蛋白Claudin-1以及Muc1 mRNA的表达量并没有显著影响(P＞0.05），但能够显著升高IPEC-J2中CAT1、ASCT1、EAAT3的mRNA以及SGLT1、GLUT2蛋白的表达水平(P＜0.05，P＜0.01)，同时吸收转运葡萄糖和部分氨基酸（如Lys、His、Arg和Thr）的效率也有相应提高(P＜0.05，P＜0.01)。这些结果表明，适当降低正常培养基中精氨酸的浓度(0.2 mM)能够促进肠上皮细胞营养转运载体SGLT1、GLUT2、CAT1、ASCT1和EAAT3的表达，更有利于IPEC-J2对葡萄糖和部分氨基酸的吸收转运;同时能够维持细胞间紧密连接的形成以及粘蛋白Muc1和Muc2的表达。该研究从分子生物学的角度解析外源精氨酸对细胞屏障和营养吸收功能的影响，进而为精氨酸在猪生长过程中的作用研究奠定理论基础。
　　试验三:CAT1作为一种重要的碱性氨基酸转运载体，是最主要的y+系统转运蛋白，几乎在所有组织细胞中表达，尤其肠道上皮细胞中高表达。试验三进一步研究碱性氨基酸转运载体CAT1在肠上皮细胞中发挥的功能，以及其引起细胞内信号转导的调节机制。本研究成功构建了CAT1-GFP融合基因的慢病毒表达载体，通过在肠上皮细胞IPEC-J2中过表达或干扰CAT1，深入研究CAT1在细胞中是如何参与细胞内部信号调控的。研究发现在肠上皮细胞IPEC-J2中过表达或干扰后CAT1会引起细胞中表皮生长因子受体(EGFR)的表达发生相应变化，CAT1的表达与EGFR表达量存在正相关关系，但具体机制仍需进一步研究。

目录

论文说明

声明

摘要

中英文缩略表

20种常见氨基酸的英文及缩写

引言

第一章 猪饲料日粮氮营养素的应用现状

1 日粮氮营养素的重要性

2 国内外养猪生产对于氮营养素利用的研究进展

3 猪饲粮氮营养素存在的问题：包括来源、浓度高低和对环境等影响

参考文献

第二章 氮营养素对猪肠道黏膜营养吸收功能的影响

1 氮营养素在小肠吸收利用机制的研究进展

2 肠道黏膜氨基酸的吸收感应机制

3 肠道黏膜葡萄糖的吸收感应机制

4 氮营养素的调节对猪肠道吸收营养物质的影响

参考文献

第三章 氮营养素对肠黏膜屏障功能的影响

1 猪肠道黏膜屏障功能

2 氮营养素对猪肠上皮黏膜结构屏障的影响研究进展

3 氮营养素对猪肠黏膜免疫功能的影响研究进展

参考文献

第四章 不同氮营养素水平日粮对猪肠道黏膜屏障和营养吸收功能的影响的研究

摘要

1 材料与方法

1．1 试验动物与日粮

1．2 主要试剂和仪器

1．3 抗体

1．4 荧光定量PCR法检测空肠黏膜中Muc1 mRNA、Muc2 mRNA的水平

1．5 Western-Blot蛋白印迹检测肠黏膜氨基酸转运载体和紧密连接蛋白的表达水平

1．6 HE染色观察肠道形态

1．7 希夫反应法(PAS法)显示空肠杯状细胞

2．1 不同粗蛋白水平日粮对猪肠道形态和杯状细胞数目的影响

2．2 不同粗蛋白水平日粮对肠黏膜黏蛋白mRNA和紧密连接蛋白表达水平的影响

2．3 不同粗蛋白水平日粮对猪肠黏膜上氨基酸转运载体表达量的影响

2．4 不同粗蛋白水平日粮对猪肠黏膜上葡萄糖转运载体表达量的影响

3 讨论

参考文献

第五章 不同浓度精氨酸对IPEC-J2细胞屏障及其营养吸收功能的影响的研究

摘要

1．1 细胞株

1．2 主要试剂和仪器

1．3 细胞培养

1．6 Western-Blot检测IPEC-J2细胞葡萄糖转运载体和紧密连接蛋白的表达水平

1．7 葡萄糖测定试剂盒检测IPEC-J2细胞培养基中葡萄糖含量

2．1 不同浓度精氨酸对IPEC-J2细胞紧密连接和粘蛋白表达量的影响

2．2 不同浓度精氨酸对IPEC-J2细胞氨基酸转运载体表达量的影响

2．3 不同浓度精氨酸对IPEC-J2细胞氨基酸吸收水平的影响

2．4 不同浓度精氨酸对IPEC-J2细胞葡萄糖转运载体蛋白和葡萄糖吸收水平的影响

3 讨论

参考文献

第六章 氨基酸转运载体CAT1调节肠上皮细胞EGFR信号通路的初步探究

摘要

1 材料与方法

1．1 细胞株

1．2 抗体和质粒

1．3 主要试剂和仪器

1．5 pLVX-sh-CAT1和pLVX-sh-Control载体的构建及慢病毒的包装

1．6 Western-Blot检测IPEC-J2中CAT1、EGFR和ERK的表达水平

1．8 流式检测干扰CAT1后IPEC-J2的细胞凋亡水平

1．9 数据处理

2 试验结果

2．1 pLVX-AcGFP1-CAT1载体构建和慢病毒包装结果

2．2 pLVX-sh-CAT1载体的构建和慢病毒包装结果

2．3 慢病毒转染IPEC-J2细胞后干扰和过表达CAT1的效果

2．4 干扰CAT1表达对IPEC-J2凋亡、吸收葡萄糖和精氨酸的影响

2．5 过表达和干扰CAT1转运载体对EGFR和ERK表达量的影响

3 讨论

参考文献

全文结论

论文发表情况

致谢