棉花岩藻糖基转移酶家族基因(FucT)的发掘和FucT4功能初步分析

摘要

棉纤维是世界上最重要的纺织原料之一，具有重要的经济价值。棉纤维形成过程涉及到很多基因的表达，了解这些基因的功能对于改良棉纤维品质具有重要的意义。
　　Ligon lintless(Li1)是十九世纪30年代发现的棉花短纤维突变系，发育迟缓并且叶片和茎呈扭曲状。本实验室通过李氏正常纤维野生型(li1li1)和李氏无纤维突变体（Li1li1）两个材料的10 DPA纤维基因芯片分析结果，发现了一个与棉纤维伸长发育显著相关的EST序列（EST编号为G070B08A），电子克隆得到该基因的完整CDS序列。BLAST分析其与α1，3/4-岩藻糖基转移酶基因高度同源，与拟南芥AtFUT13基因具有69％的一致性。该基因在棉花中没有被报道过，所以我们命名该基因为GhFucT。
　　本试验基于陆地棉遗传标准系TM-1基因组序列信息，对FucT基因家族进行了全基因组鉴定。序列分析表明，基因芯片中得到的GhFucT基因与全基因组鉴定得到的GhFucT4基因为同一基因。进化分析、转录组数据分析、qRT-PCR表达分析和纤维品质关联分析都表明GhFucT4基因对棉纤维发育具有重要作用。随后，通过拟南芥转化实验进一步验证了GhFucT4基因在细胞伸长中的作用。主要研究结果如下:
　　1.在异源四倍体陆地棉TM-1(AADD)基因组数据库中鉴定出8条FucT基因，At亚组和Dt亚组分别含有4条，共分布于6条染色体上。聚类和进化分析表明，FucT基因分为两大类，一类包含GhFucT1～GhFucT3，另一类只包含GhFucT4。
　　2.依据陆地棉转录组数据，对FucT家族基因在陆地棉不同组织的表达特征进行分析，发现该家族基因的表达量差异较大。GhFucT1和GhFucT3基因在陆地棉各个组织和器官中表达量极低;GhFucT2基因在叶片中表达较高，在其它组织中较低;GhFucT4基因在茎、叶和0 DPA的胚珠中表达量较低，但在根及不同发育时期的纤维中表达量很高。qRT-PCR结果也表明GhFucT4基因在棉纤维中优势表达，且在棉纤维品质较好的海岛棉H7124材料中，FucT4基因表达量比陆地棉TM-1中要高。随后，利用陆地棉自然群体进行棉纤维品质关联分析，结果表明，GhFucT4基因与棉纤维长度、比强度、衣分等品质性状存在显著或极显著相关性。以上结果说明FucT4对棉纤维的发育及品质形成具有重要作用。
　　3.通过对FucT4基因在拟南芥中的异位表达，进一步验证了FucT4基因在细胞伸长过程中的作用。将克隆得到的H7124中的GbFucT4A亚组基因构建于双元载体，转化到拟南芥中，得到阳性转基因植株，并进行表型观察。结果表明，GbFucT4过量表达使拟南芥幼苗初生根显著变长，进一步分析表明转基因拟南芥初生根细胞相比于野生型明显变长。这一结果说明α1，3/4-岩藻糖基转移酶FucT4对于细胞的伸长具有重要作用。
　　基于上述分析，本研究表明棉花中FucT4基因可能是参与棉纤维发育的主要FucT基因，该基因对于棉纤维的发育及品质性状的形成具有重要作用。

目录

声明

摘要

本文所使用的缩略词

第一章 棉纤维发育机制的研究进展

1 棉纤维发育过程概述

2 棉纤维细胞起始发育

2．1 棉纤维细胞的分化和起始发育

2．2 棉纤维细胞起始发育的相关基因的研究进展

3 棉纤维细胞的伸长和初生壁合成

3．1 棉纤维细胞的伸长

3．2 初生壁的形成

3．3 影响棉纤维伸长和初生壁形成的相关基因研究进展

4 棉纤维细胞次生壁的沉积

4．1 棉纤维次生壁的合成

4．2 棉纤维次生壁沉积相关基因的研究进展

5 棉纤维的脱水成熟

第二章 植物细胞壁研究进展

1 细胞壁的功能

2 细胞壁的组成

2．1 纤维素

2．2 果胶

2．3 半纤维素

2．4 木质素

第三章 N-连接糖基化的研究进展

1 N-糖基化在生物体中的修饰

2 岩藻糖基转移酶的相关研究进展

2．2 α1，3／4-岩藻糖基转移酶的研究进展

3 N-多聚糖糖蛋白的生物学意义

本研究的目的和意义

第四章 岩藻糖基转移酶基因的全基因组鉴定及功能初步分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 生物信息学分析

1．3 培养基

1．4 菌株

1．5 棉花叶片DNA的快速提取

1．6 棉花RNA的提取和反转

1．7 GhFucT4基因ORF序列的PCR扩增

1．8 PCR扩增产物的回收、连接

1．9 回收产物的转化和检验

1．10 实时荧光定量RT-PCR

1．11 SNP引物的设计

1．12 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2 结果与分析

2．1 FucT基因的基本生物信息学分析

2．2 FucT在陆地棉TM-1中的全基因组鉴定

2．3 FucT家族基因在TM-1中的染色体定位

2．4 FucT基因在不同物种中的聚类分析

2．5 棉花FucT基因在陆地棉TM-1中的表达谱分析

2．6 GhFucT4基因克隆及基因结构分析

2．7 FucT4基因在海岛棉和陆地棉中的qRT-PCR分析

2．8 陆地棉群体的关联分析

3 讨论

第五章 GbFucT4在拟南芥中异位表达功能分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 菌株和载体

1．3 培养基

1．4 农杆菌的转化

1．5 拟南芥的侵染

1．6 转基因拟南芥纯系的获得

1．7 拟南芥叶片DNA的提取

1．8 拟南芥叶片的RNA提取

1．9 激光共聚焦显微镜的使用

2 结果分析

2．1 转基因载体的构建

2．2 转基因拟南芥的分子验证和转基因纯合株系的获得

2．3 转基因拟南芥的定量表达

2．4 转基因拟南芥的表型观察

2．5 转基因拟南芥初生根的细胞的观察

3 讨论

全文结论

参考文献

附录

致谢