水稻籽粒灌浆速率基因GFR1的图位克隆及优异等位变异在自然群体中的发掘

摘要

水稻是重要的粮食作物，随着耕地面积的减少和人口的增加，提高水稻产量成为解决粮食安全问题的必由之路，而杂交水稻的发展为水稻单产的提高作出了重要的贡献。但迄今为止，我国的杂交水稻种植中主要以杂交籼稻为主，其种植面积已达到籼稻种植面积的70％左右。相比之下，杂交粳稻种植面积只占到粳稻种植面积的5％左右，两者巨大的差距给杂交粳稻的发展带来很大空间。水稻籽粒灌浆充实度是影响粒重从而直接影响稻谷产量的重要性状。大穗是F1代杂交水稻的主要优势之一，而大稳型杂交稻尤其是大穗型杂交粳稻常常表现为籽粒灌浆不足，充实度不好，不仅达不到已有颖花数应当达到的产量，而且使整精米率下降，不能充分实现大穗型品种的增产潜力和商品价值。因此，研究和探明控制水稻籽粒灌浆速率的遗传基础和作用机理，对于确定水稻高产优质高效育种策略具有重要意义。本研究围绕上述科学问题进行了两项研究，获得的主要结果分述如下。
　　1.水稻籽粒灌浆速率基因GFR1的图位克隆
　　本实验室之前的研究利用两个粳稻品种稽稻和C堡构建的回交重组自交系群体(BC1F6)检测到一个控制籽粒灌浆速率的主效QTL qGFR10(本研究命名为GFR1)。为了研究GFR1在籽粒灌浆中的遗传效应，我们从构建的染色体片段置换系中分离出一个以C堡为背景，含有稽稻等位基因GFR1的近等基因系（NIL-qgfr1）。与C堡相比，NIL-gfr1的灌浆速率在灌浆前期显著高于C堡。两者在抽穗期、单株有效穗数、穗长、单穗总粒数和单穗实粒数上没有显著差异。NIL-gfr1在结实率、籽粒充实度、千粒重及小区产量上均显著的高于C堡，这表明NIL-gfr1灌浆速率的提高有助于水稻产量的提高。
　　我们利用NIL-gfr1和C堡构建的次级F2群体进行GFR1的精细定位。遗传分析表明GFR1是一个单孟德尔因子。利用NIL-gfr1/C堡F2群体中灌浆速率快的1614个单株，我们将GFR1定位到10号染色体长臂末端34Kb的区间内。在此区间有4个预测的开放阅读框(ORFs)，通过测序对比发现，ORF1(LOC_Os10g36400)的稽稻等位基因（GFR1-l）和C堡的等位基因（GFR1-c）的编码序列中检测到1个单核苷酸多态性(SNPs)位点和3个连续碱基的缺失。这些差异导致稽稻等位基因编码的氨基酸序列中缬氨酸到丙氨酸的改变和一个丙氨酸的缺失。通过转基因互补验证和转基因过表达验证我们证明了ORF1就是GFR1。
　　我们利用C堡和NIL-gfr1与两个不同的粳稻不育系9522A和徐2A进行了配组，来评价GFR1在杂交粳稻育种中的利用价值。结果发现近等基因系与不育系的配组在籽粒灌浆速率、充实度和小区产量上均高于对照C堡与不育系组合。因此，通过分子标记辅助选择，将稽稻等位基因导入广泛应用的不育系中，可以改善杂交粳稻亲本的籽粒灌浆速率从而提高杂交粳稻的产量。
　　2.水稻籽粒灌浆速率优异等位变异在自然群体中的发掘
　　选用263个SSR标记对由58个地方品种和37个推广品种构成的核心种质群体进行基因型鉴定，并于2011年和2012年调查该群体5个时期（开花后7天、14天、21天、28天和35天）的籽粒灌浆速率。
　　在95个水稻核心种质构成的群体中，5个籽粒灌浆时期水稻籽粒灌浆速率的表型变异很大，变异系数变幅为36.49％到118.26％，广义遗传率为87.5％到96.8％。群体结构分析表明，该核心种质群体被划分为7个亚群。连锁不平衡分析显示，地方品种和推广品种LD衰减(D'＜0.5)所延伸的最小距离分别是84.8 cM和60.3 cM，这表明地方品种LD衰减速度较推广品种慢。
　　两年共检测到与5个灌浆期籽粒灌浆速率相关的标记24个，分布于水稻的1、2、3、4、5、6、8、9、11和12号染色体上。5个不同灌浆期检测到的标记分别为12、8、2、5和4，其中7个标记(RM480，RM5818，RM525，RM6361，RM6314，RM224和RM72)与两个时期籽粒灌浆速率相关。其中，贡献率最高的标记位点是位于6号染色体的RM528，该标记与籽粒灌浆速率的14DAF时期显著关联，在2011年和2012年的贡献率分别为25.87％和27.19％。
　　预测了15组优异亲本组合，其中最优组合‘南农粳62401×老来红’在整个灌浆期理论上可以使灌浆速率提高4.086 mg grain-1 d-1。这些有利等位变异的载体品种可用作水稻籽粒灌浆速率遗传改良的亲本，通过聚合育种来提高水稻籽粒灌浆速率。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1．1 杂交粳稻的发展

1．2 杂交粳稻育种的现状及对策

2 水稻籽粒灌浆特性研究概况

2．1 水稻强弱势粒灌浆特性研究

2．2 水稻不同品种间籽粒灌浆特性研究

3 水稻籽粒灌浆机理研究概况

3．1 “源”的供应

3．2 “库”的限制

3．3 “流”的通畅

4 水稻籽粒灌浆分子机制研究概况

4．1 酶活性和同化物转运相关基因

4．2 细胞壁转化酶基因

4．3 植物激素相关基因

4．4 胚乳发育相关基因

4．5 siRNA和miRNAs对籽粒灌浆的调控

4．6 磷酸化蛋白质组学

4．7 水稻籽粒灌浆相关性状研究

5 植物数量性状遗传定位概况

5．1 基于遗传分离群体的连锁定位

5．2 条件QTL定位

5．3 基于自然群体的关联定位

5．4 连锁定位与关联定位的对比

6 本研究的目的与意义

第二章 水稻籽粒灌浆速率基因GFR1的图位克隆

1．1 供试材料

1．2 田间种植与性状调查

1．3 生理生化指标的测定

1．4 灌浆早期胚乳样品的透射电镜观察

1．5 灌浆后期种子断面的扫描电镜观察

1．6 植物总DNA的提取及标记基因型鉴定

1．7 标记开发及精细定位

1．8 候选基因预测与同源性分析

1．9 RNA提取与qRT-PCR分析

1．10 转基因互补载体和过表达载体的构建

1．11 植物转化

1．12 转基因阳性植株的鉴定

1．14 穞稻等位基因GFR1的育种利用评价

2 结果与分析

2．1 水稻籽粒灌浆速率QTL分析及NIL-gfr1的分离

2．2 亲本籽粒灌浆速率相关表型的鉴定

2．3 GFR1的精细定位

2．4 GFR1候选基因的预测

2．5 GFR1的表达模式分析

2．6 转基因验证

2．7 GFR1基因位点穞稻等位基因可以提高杂交稻的产量

3 讨论

3．3 GFR1是一个新的参与调控籽粒灌浆速率的关键基因

第三章 水稻籽粒灌浆速率优异等位变异在自然群体中的发掘

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 田间种植与性状调查

1．3 SSR标记基因型鉴定

1．4 数据分析

2 结果与分析

2．1 水稻灌浆期温度的变化

2．2 水稻95个品种籽粒灌浆速率的表现

2．3 263个SSR标记位点的遗传多样性

2．4 地方品种群体和推广品种群体SSR位点间的连锁不平衡及其衰减

2．5 品种总群体结构分析

2．6 与水稻籽粒灌浆速率相关联的SSR位点

2．7 5个时期水稻籽粒灌浆速率的优异等位变异

2．8 提高籽粒灌浆速率的优异亲本组合预测

2．9 GFR1特异标记B在95个水稻品种中的基因型鉴定

3 本章讨论

3．1 抽穗期和糙米重变异对水稻籽粒灌浆速率的影响

3．2 研究籽粒灌浆速率使用时间过程方法的重要性

3．3 水稻种质群体遗传多样性的比较

3．4 群体结构分析和LD连锁分析在关联定位中的意义

3．5 时间过程的关联定位在籽粒灌浆速率研究中的优势

3．6 改善籽粒灌浆速率的优异亲本组合预测

第四章 全文总结

1 全文结论

1．2 发掘了5个灌浆期水稻籽粒灌浆速率的优异等位变异

2 本研究的创新之处

参考文献

附表

发表与撰写的学术论文

致谢