产链孢红素枯草芽孢杆菌增强仔猪肠道黏膜免疫功能的研究

摘要

由不同病原引起的仔猪腹泻是养猪场普遍存在的肠道传染病。近几年该病的频繁发生已给我国乃至世界养猪业造成了极大的经济损失。仔猪肠道黏膜免疫系统发育不健全是仔猪发生腹泻性疾病的重要原因。因此，促进仔猪黏膜免疫系统的发育，提高黏膜免疫功能有利于降低腹泻性疾病的发生。近年来，越来越多的研究发现类胡萝卜素具有促进免疫器官发育，增强免疫的作用。另外，枯草芽孢杆菌作为一种传统益生菌具有促进动物生长的作用，已被广泛用作动物饲料添加剂。将枯草芽孢杆菌的益生效果与类胡萝卜素提高免疫功能的作用结合起来为我们增强仔猪肠道免疫功能提供了新的思路。因此，本研究首先构建含有不同类胡萝卜素合酶的质粒并导入枯草芽孢杆菌，之后筛选能够产生类胡萝卜素的菌落，并对色素成分进行鉴定;其次，我们通过流式细胞术、共聚焦显微镜等技术比较了枯草芽孢杆菌合成的类胡萝卜素和β-胡萝卜素在小鼠树突状细胞成熟、抗原摄取、迁移等过程中的作用，并且进一步研究了类胡萝卜素对树突状细胞胞内信号传递及表面受体的影响;再次，在小鼠模型上，我们通过鼠伤寒沙门氏菌攻毒试验评价了产链孢红素枯草芽孢杆菌对肠道黏膜免疫功能的影响，并深入探究了其细胞和分子机制;最后，我们在仔猪模型上研究了产链孢红素枯草芽孢杆菌对肠道黏膜免疫系统发育的影响。我们的研究初步证明了产链孢红素枯草芽孢杆菌作为黏膜免疫增强剂的潜在应用价值。本研究分为以下四个部分: 1产类胡萝卜素枯草芽孢杆菌的构建 本试验通对crtY、crtI、crtB、crtE、crtM和crtN六种类胡萝卜素合成相关酶的组合筛选，最终利用crtM和crtN在枯草芽孢杆菌中合成了色素。通过丙酮-正己烷抽提我们得到了高纯度的色素成分，并对其进行高效液相色谱鉴定。结果表明，枯草芽孢杆菌中合成的色素为C30类胡萝卜素，4'4-双阿朴链孢红素(4，4'-diaponeurosporene，Dia，以下简称链孢红素)。对产链孢红素枯草芽孢杆菌连续传代发现链孢红素能够在细菌中稳定合成。高纯度链孢红素的获得有助于我们进一步研究其生物学功能。此外，具有遗传稳定性的产链孢红素枯草芽孢杆菌的构建为链孢红素的大规模发酵生产提供了菌种保障。 2链孢红素对树突状细胞的作用及其作用机制 类胡萝卜素是一类具有光保护活性的生物色素成分，根据碳骨架长度不同可分为30个碳原子的C30类胡萝卜素和40个碳原子的C40类胡萝卜素。以β-胡萝卜素为代表的C40类胡萝卜素的免疫学作用已被广泛研究，而C30类胡萝卜素的免疫功能仍不清楚。本研究首次鉴定了C30类胡萝卜素(4，4'-diaponeurosporene，Dia)对小鼠树突状细胞的作用。我们发现1μM Dia作用树突状细胞(dendritic cell，DC)24小时能有效地诱导DC成熟，表现为具有成熟状态的形态特征，成熟表型上调以及细胞因子分泌量增加。而同样浓度的β-胡萝卜素具有抑制DC成熟的作用。此外，Dia能够促进DC对抗原(OVA)的摄取和向引流淋巴结迁移。而且Dia作用后的DC诱导Th1细胞分化的能力显著提高，提示Dia具有促进细胞免疫的作用。进一步研究表明，Dia通过细胞表面的CD36诱导DC成熟，并且在此过程中胞内ERK、JNK和NK-κB的活化是必需的。以上研究首次揭示了C30类胡萝卜素的免疫促进作用，为后续研究奠定了基础。 3产链孢红素枯草芽孢杆菌对小鼠肠道黏膜免疫功能的影响 在前面的研究中，我们发现链孢红素(Dia)具有诱导DC成熟，并促进Th1细胞分化等作用。但产生Dia的枯草芽孢杆菌(B.s-Dia)是否具有提高黏膜免疫的功能尚不清楚。因此，本研究首先检测了B.s-Dia对小鼠黏膜免疫功能的影响。结果发现，连续灌胃B.s-Dia7天显著提高了小鼠抵抗沙门氏菌感染的能力。进一步研究表明，B.s-Dia能够促进肠上皮细胞产生CCL20，从而提高肠道固有层中DC数量，并且Th17和Treg细胞数量也明显升高。再进一步的研究发现CD36信号是B.s-Dia诱导肠上皮细胞产生CCL20所必需的，因为当B.s-Dia同时与CD36特异性阻断剂(SSO)共同灌胃时，不能诱导肠上皮细胞产生CCL20，同时B.s-Dia也失去提高小鼠黏膜免疫功能的作用。此外，B.s-Dia显著降低了具有抑制作用的CD8αα+上皮内淋巴细胞的比例，这一过程可能与肠上皮细胞分泌的TGFβ量降低有关。以上结果初步表明B.s-Dia具有提高肠道黏膜免疫功能的作用。 4产链孢红素枯草芽孢杆菌对仔猪黏膜免疫系统的影响 本试验评价了饲喂产链孢红素枯草芽孢杆菌对仔猪肠道黏膜免疫系统的影响。结果表明，饲喂产链孢红素枯草芽孢杆菌显著促进了仔猪派尔氏斑的发育并且增加了结肠隐窝深度和杯状细胞的数量。产链孢红素枯草芽孢杆菌能够提高回肠上皮内淋巴细胞的数量，而不产链孢红素的枯草芽孢杆菌无显著作用。此外，在饲喂产链孢红素枯草芽孢杆菌后，仔猪肠道IgA+细胞和CD4+以及CD8+细胞数量显著增多。以上结果初步表明，产链孢红素枯草芽孢杆菌具有比枯草芽孢杆菌更好的促进仔猪肠道黏膜免疫系统发育的能力，具有作为黏膜免疫增强剂的应用价值。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语中英文对照表

引言

第一章类胡萝卜素及其生物学功能

3类胡萝卜素的鉴定

4类胡萝卜素的合成及相关酶类

4．2类胡萝卜素合成相关酶类

5类胡萝卜素的生物学活性

5．2类胡萝卜素与肿瘤

6类胡萝卜素合成基因工程

第二章肠道黏膜免疫与递送载体

1黏膜免疫

1．1黏膜免疫与系统免疫的区别

1．2肠道黏膜免疫系统及其淋巴组织

1．3肠道黏膜免疫相关细胞

2黏膜递送载体

2．1微颗粒和纳米颗粒

2．2免疫刺激复合物

2．3病毒样颗粒

2．4活病毒载体

2．5细菌载体

第三章产类胡萝卜素枯草芽孢杆菌的构建

1材料与方法

1．1菌株

1．2试验设备

1．3试验试剂

1．4类胡萝卜素合酶表达质粒的构建

1．6类胡萝卜素的提取和鉴定

2结果

2．1类胡萝卜素合酶表达质粒的构建

2．2产类胡萝卜素枯草芽孢杆菌的构建

2．4类胡萝卜素的提取和鉴定

3讨论

参考文献

第四章链孢红素对树突状细胞的作用

1材料与方法

1．1试验动物

1．2试验设备

1．3试验试剂和耗材

1．4链孢红素的提取及对照提取物的制备

1．5小鼠树突状细胞的原代诱导培养

1．6树突状细胞的处理

1．7细胞表面抗原和胞内抗原的流式检测

1．8 ELISA检测树突状细胞分泌细胞因子水平

1．9树突状细胞抗原摄取能力的检测

1．10树突状细胞迁移能力检测

1．11磁珠分选naive CD4+T细胞

1．12链孢红素处理的树突状细胞对T细胞分化的影响

1．13 Western blot检测树突状细胞MAPK和NF-κB活化水平

1．14树突状细胞中活性氧的检测

1．15一氧化氮和超氧化物歧化酶的检测

1．16 CD36抗体阻断试验

1．17数据统计

2结果

2．1小鼠树突状细胞的鉴定

2．2链孢红素对树突状细胞的安全剂量

2．3链孢红素对树突状细胞成熟的影响

2．4不同碳骨架长度的类胡萝卜素对树突状细胞成熟的作用

2．4链孢红素对树突状细胞抗原摄取的作用

2．5链孢红素对树突状细胞迁移能力的作用

2．6链孢红素对树突状细胞刺激同种异型CD4+T细胞的影响

2．7链孢红素诱导树突状细胞成熟过程中MAPK和NF-κB信号通路的作用

2．8链孢红素对树突状细胞氧化还原状态的影响

2．9 CD36在链孢红素诱导树突状细胞成熟过程中的作用

3讨论

参考文献

第五章产链孢红素枯草芽孢杆菌对小鼠肠道黏膜免疫功能的影响

1材料与方法

1．1试验动物、细胞株及菌株

1．2试验设备

1．3试验试剂

1．4产链孢红素枯草芽孢杆菌的构建

1．5试验分组

1．6细菌计数

1．7树突状细胞的原代诱导培养

1．8肠道固有层淋巴细胞和肠上皮内淋巴细胞的分离

1．9细胞表面抗原和胞内细胞因／转录因子染色

1．10免疫荧光检测小鼠肠道树突状细胞数量和趋化因子产量

1．11 ELISA检测细胞因子

1．12数据统计

2结果

2．1产链孢红素枯草芽孢杆菌对小鼠体重和肠道组织形态的影响

2．2产链孢红素枯草芽孢杆菌对小鼠抗鼠伤寒沙门氏菌能力的影响

2．3产链孢红素枯草芽孢杆菌对小鼠肠道固有层树突状细胞的影响

2．4产链孢红素枯草芽孢杆菌对小鼠肠道固有层中Th17和Treg细胞的影响

2．5产链孢红素枯草芽孢杆菌对肠上皮内淋巴细胞的影响

2．6产链孢红素枯草芽孢杆菌对小鼠肠上皮细胞细胞因子产生的影响

2．7 CD36信号在产链孢红素枯草芽孢杆菌增强黏膜免疫过程中的作用

3讨论

参考文献

第六章产链孢红素枯草芽孢杆菌对仔猪黏膜免疫的影响

1材料与方法

1．1试验动物、细胞株及菌株

1．2试验设备

1．3试验试剂

1．4产链孢红素枯草芽孢杆菌的构建

1．5试验分组

1．6 HE染色检测猪肠道形态学变化

1．8免疫荧光检测仔猪肠道固有层CD4+CD8+细胞数量

1．9免疫组化检测仔猪肠道固有层IgA+细胞数量

1．10 ELISA检测肠道细胞因子产生水平

1．11数据统计

2结果

2．1饲喂产链孢红素枯草芽孢杆菌对仔猪日增重的影响

2．2饲喂产链孢红素枯草芽孢杆菌对仔猪肠道发育的影响

2．3饲喂产链孢红素枯草芽孢杆菌对仔猪小肠上皮内淋巴细胞数量的影响

2．4饲喂产链孢红素枯草芽孢杆菌对仔猪肠道IgA+细胞数量的影响

2．4饲喂产链孢红素枯草芽孢杆菌对仔猪肠道CD4+和CD8+细胞数量的影响

3讨论

参考文献

全文结论

本文创新点

论文发表情况

致谢