独脚金内酯调控菊花抗蚜性机制研究

摘要

菊花（Chrysanthemum morifolium）是我国十大传统名花和世界四大切花之一，观赏、经济价值极高。蚜虫是严重为害菊花的最主要害虫，整个生长季节危害均十分严重，且化学防治困难。蚜虫作为刺吸式昆虫，主要取食韧皮部汁液，消耗植株养分，同时还传播病毒病、诱发霉污病等，严重影响菊花产量与观赏品质。蚜虫为害已成为限制我国菊花产业化健康发展的主要瓶颈之一。独脚金内酯是一类新型的植物激素，调控植物诸多生长发育过程，如抑制植株地上部分枝，促进不定根形成、根毛伸长，茎的次生生长和节间伸长等。近期有研究发现，独脚金内酯可与多种防御激素（病虫生物胁迫、非生物胁迫）交互对话，从而调控拟南芥的抗旱性、耐盐性及抗病性。然而，关于独脚金内酯调控植物抗蚜性方面的研究国内外尚未见报道。本研究旨在探讨独脚金内酯是否调控菊花抗蚜性？其调控抗蚜性的具体机制是什么？以期为菊花蚜虫防治及减药栽培提供科学依据，亦可揭示独脚金内酯的新生物学功能。本研究的主要内容与结论如下: 1.通过设计简并引物，结合RACE-PCR技术，从切花菊‘神马’中克隆得到了独脚金内酯合成基因CmCCD8。通过与其他物种中同源CCD8氨基酸比对和系统进化树分析发现，菊花CmCCD8和矮牵牛PhCCD8/DAD1的同源性最高。组织表达模式分析显示，CmCCD8基因在根中的表达量最高，其次是茎，在叶片中表达量最低，其受独脚金内酯类似物GR24和蚜虫诱导表达。构建了pBIG-CmCCD8超表达载体，并通过农杆菌介导的叶盘转化法获得了CmCCD8超表达转基因菊花OX-1、OX-2。CmCCD8超表达株系内源SL的含量测定显示，发现SL类似物361在OX-1、OX-2中的含量高于野生型WT，而SL类似物363、371含量低于WT，并且呈现显著差异。表明CmCCD8具有编码独脚金内酯合成酶催化独脚金内酯合成的功能。 2.对外源GR24处理及CmCCD8过量表达转基因株系OX-1和OX-2进行了抗蚜性鉴定，发现转基因株系的虫口密度显著高于野生型。刺探电位图谱(EPG)显示蚜虫取食转基因株系的第一次细胞穿刺时间(Pd)、非刺吸阶段的总时间（np）和完成第一次成功刺探的时间(C)均比野生型中的时间短，且在转基因株系叶片韧皮部的取食时间显著长于野生型。叶片表皮微观形态和解剖结构分析表明，转基因株系抗蚜性的减弱与叶片表面表皮毛密度较低、叶片厚度、栅栏组织厚度及下表皮厚度减少有关。叶片中木质素、纤维素和半纤维素含量较野生型低，从而对蚜虫的机械防御减弱。转录组分析发现，转基因株系中木质素合成路径Cm4CL2、CmCCR2和CmCAD6基因、纤维素合成路径CmCesA3和CmCesA8基因、调控木质素合成的差异表达转录因子CmMYB19、CmMYB46和CmNA C2基因的表达均显著低于野生型植株。利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对野生型‘神马’及转基因株系叶片初生代谢产物进行了鉴定，结果发现转基因株系叶片中丙酮醇、十六碳烯酸、粪甾烷酸、二甲基组氨酸、2，4-二氨基丁酸及京都啡肽等初生代谢物的含量明显低于野生型，表明独脚金内酯可调控菊花的机械防御及减少初生代谢物中的毒杀成分从而调控菊花的抗蚜性。 3.外源GR24处理及转基因植株的蚜虫取食趋避性分析发现，GR24处理下及转基因植株对蚜虫的趋避性减弱。叶片挥发物成分分析显示，转基因株系与野生型相比，有14种萜烯含量发生变化，其中驱避性萜烯(E)-β-Farnesene和β-Caryophyllene在转基因植株中的含量显著下降。在野生型和转基因株系中，外源(E)-β-Farnesene和β-Caryophyllene增加了植株对蚜虫的驱避性。转录组分析发现，蚜虫驱避性萜烯(E)-β-Farnesene和β-Caryophyllene合成基因CmTPS1和CmTPS2在转基因株系中的表达量较野生型显著下调。GR24处理下、CmCCD8超表达植株中CmNCED3a的表达下调，且转基因株系中内源ABA含量显著低于野生型植株;外源喷施55μM、110μM ABA能够增强对蚜虫的驱避性，处理24h后，CmTPS1、CmTPS2的表达水平较对照低。GR24处理下、CmCCD8超表达株系中SA合成基因CmICS的表达较对照显著上调，CmCCD8超表达植株中内源SA含量高于野生型植株，外源喷施SA可促进CmTPS1、CmTPS2基因的表达，增强对蚜虫的驱避性。外源GR24处理下、CmCCD8超表达株系中JA合成基因CmAOS和CmLOX2的表达无显著变化，且野生型和CmCCD8超表达植株中JA含量没有显著差异，外源喷施JA可以增加植株对蚜虫的驱避作用，同时可促进CmTPS1、CmTPS2基因的表达。借助TRV-VIGS沉默菊花脑CnCCD8的沉默株系（TRV2e-CnCCD8-1，2，3，4组）对蚜虫的驱避性强于转TRV2e-GFP空载植株，且沉默株系中CnTPS1和CnTPS2基因的表达较空载转化株显著上调，且(E)-β-Farnesene和β-Caryophyllene的含量显著增加。进一步证实了SL负调控萜烯(E)-β-Farnesene和β-Caryophyllene的合成从而降低对植株对蚜虫的驱避性。综上，SL介导的对蚜虫驱避性的降低可能是独脚金内酯(SL)或SL与ABA、SA共同调控驱避萜烯合成所致。

目录

声明

摘要

缩略词表

绪论

第一章文献综述

1独脚金内酯的合成及信号转导

1．1独脚金内酯(SL)的发现

1．2独脚金内酯(SL)的生物合成

1．3独脚金内酯的信号转导

1．4独脚金内酯的生物学功能

2植物防御反应

2．1植物对蚜虫的物理防御

2．2植物对蚜虫的化学防御

3蚜虫诱导的植物防卫信号途径

3．1 JA／ET防卫信号路径

3．2 SA防卫信号路径

3．3 SA与JA／ET信号问的交互对话

3．4 SL与JA、SA信号间的交互对话

4菊花抗蚜性研究进展

4．1 菊姬长管蚜的生物学特性

4．2菊花抗蚜性机制研究进展

5本研究的目的和意义

第二章SL合成基因CmCCD8克隆与菊花遗传转化

1材料与方法

1．1试验材料、化学试剂、表达载体与菌株

1．2外源GR24处理

1．3 CmCCD8基因的克隆与序列分析

1．4 CmCCD8基因的表达模式分析

1．5 pBIG-CmCCD8植物表达载体构建及遗传转化

1．6 CmCCD8超表达转基因菊花‘神马’内源SL类似物含量测定

2结果与分析

2．1 CmCCD8基因的克隆获得及序列特征

2．2 CmCCD8基因的表达特性

2．3 CmCCD8超表达遗传转化菊花及转基因植株鉴定

2．4 CmCCD8超表达转基因菊花‘神马’内源SL含量

3讨论与结论

第三章独脚金内酯调控菊花机械防御及初生代谢的抗蚜性机制

1材料与方法

1．1植物材料、化学试剂

1．2外源GR24处理

1．3转基因株系的抗蚜性鉴定

1．4蚜虫取食刺吸电位检测

1．5叶表皮微观形态观察

1．6罗丹明B荧光检测法

1．7叶片解剖结构观察

1．8木质素含量的测定

1．9纤维素含量的测定

1．10半纤维素含量的测定

1．11 RNA-Seq发掘CmCCD8超表达植株中细胞壁合成相关差异基因

1．12 CmCCD8超表达植株中细胞壁合成相关差异表达基因的qRT-PCR分析

1．13 CmCCD8超表达转基因株系叶片初生代谢组分析

2结果与分析

2．1不同浓度GR24处理对菊花蚜虫增殖的影响

2．2 CmCCD8转基因植株的抗蚜性鉴定

2．3 CmCCD8转基因植株的蚜虫取食刺吸电位(EPG)图谱

2．4 CmCCD8转基因植株叶片表面结构特征

2．5 CmCCD8转基因植株叶片解剖结构特征

2．6 CmCCD8转基因植株细胞壁中木质素、纤维素、半纤维素含量

2．7 CmCCD8转基因植株细胞壁组分合成相关差异基因

2．8 CmCCD8转基因植株细胞壁合成相关差异基因的qRT-PCR验证

2．9 CmCCD8转基因植株叶片初生代谢组

3结果与讨论

3．1独脚金内酯介导菊花对蚜虫的敏感性

3．2独脚金内酯影响叶片结构从而影响抗蚜性

3．3独脚金内酯抑制细胞壁成分的合成，从而削弱菊花抗蚜性

3．4独脚金内酯调控叶片初生代谢物的合成从而降低菊花抗蚜性

第四章独脚金内酯调控菊花蚜虫趋避性机理研究

1材料与方法

1．1植物材料、化学试剂

1．2外源激素处理

1．3 pTRV2e-GFP-CnCCD8沉默载体构建

1．4 pTRV2e-GFP-CnCCD8沉默载体瞬时转化菊花脑

1．5“Y”型嗅觉仪——蚜虫趋避性试验

1．6叶片挥发物的采集

1．7 GC-MS程序与色谱条件

1．9转基因‘神马’内源激素的测定

1．10荧光实时定量PCR

2结果与分析

2．1 “Y”型嗅觉仪-蚜虫趋避性试验

2．2 CmCCD8转基因株系叶片的挥发性成分分析

2．3 CmCCD8转基因株系萜类相关差异表达基因

2．4独脚金内酯对萜烯的合成调控

2．5独脚金内酯减弱了ABA诱导的抗蚜性

2．6独脚金内酯增强了SA对部分驱避萜烯合成的抑制作用

2．7转基因株系中(E)-β-Farnesene和β-Caryophyllene不受JA调控

2．8 TRV2e-GFP-CnCCD8瞬时沉默菊花脑植株的获得

2．9菊花脑CnCCD8沉默株系对蚜虫的驱避性增强

3讨论与结论

3．1 SL抑制驱避类萜烯的合成从而降低菊花对蚜虫的趋避性

3．2 SL与主要防御激素协同调节萜烯合成及蚜虫趋避性

全文结论

创新点

参考文献

附录

攻读学位期间发表论文、申请专利及参与的科研项目

致谢