灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)中与咯菌腈作用机理相关基因BcSln1和BcSho1的生物学功能研究

摘要

由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是世界十大病害之一，可引起以番茄、葡萄、草莓等为主的至少200多种植物发病。由于灰葡萄孢菌繁殖速度快，变异性强，转座子活跃，目前该病仍以化学防治为主。但用于防治灰霉病的大多数药剂都已产生抗药性，甚至失效。咯菌腈作为一种新型杀菌剂，作用机制独特，对防治灰霉病有特效，在许多国家均已登记使用，但在我国尚处于早期阶段，近几年逐渐开始用于灰霉病的防治。已有报道咯菌腈作用位点为Ⅲ型组氨酸激酶，作用机制与HOG途径相关，但其毒理学研究尚不透彻。本文通过构建灰葡萄孢菌HOG途径两个分支上游元件组氨酸激酶Sln1和细胞膜感应蛋白Sho1的敲除突变体、回复突变体及双敲突变体，研究它们生物学功能、二者之间互作关系。具体研究结果如下: 本文构建了BcSho1敲除突变体、完全回复突变体及不含跨膜结构域的部分回复突变体，发现该蛋白定位于菌体细胞膜和隔膜上;若去掉该基因跨膜结构域，则游离于细胞质中。BcSho1基因敲除导致菌体较出发菌株对咯菌腈敏感性略有下降，但与其回复突变体之间差异不显著;该基因参与调控灰葡萄孢菌对氧化胁迫、细胞壁胁迫因子敏感性，但与致病性无关;该基因在菌体对菌丝生长、温度敏感性、甘油合成、不同氮源利用能力及对碱性环境适应性方面具有重要作用，且其跨膜结构域参与调节菌体对碱性环境的适应性。 构建了BcSln1和BcSho1的单基因敲除突变体及二者的双敲突变体，研究发现BcSln1基因与灰葡萄孢菌对腐霉利的敏感性无关，BcSln1敲除突变体对咯菌腈敏感性没有变化，但在咯菌腈处理条件下菌体甘油合成量上升;而双敲除突变体ΔBcSln1-Sho1对咯菌腈敏感性增加，但甘油产生能力相对于出发菌株B05.10没有明显变化，推测可能存在其它补偿途径或相关机制。BcSln1基因与灰葡萄孢菌致病性和对温度的调控无关，与不同类型化合物产生的渗透、氧化压和细胞壁胁迫因子敏感性变化相关，但存在差异性反应。BcSln1影响菌体对碱性环境的耐受力，但与BcSho1基因没有相互作用。同时发现BcSln1和BcSho1都参与调控灰葡萄孢菌对不同氮源的利用能力，且二者之间存在相互作用。

目录

声明

摘要

符号及缩略说明表

第一章综述

1 灰霉病及防治研究现状

1．1灰葡萄孢菌概况

1．2 灰葡萄孢菌生活史及病害循环

1．3 发病因素

1．4 灰霉病防治研究现状

2苯基吡咯类杀菌剂研究现状

2．1拌种咯简介

2．2咯菌腈及其研究进展

3 HOG途径关键元件Sln1和Sho1的研究进展

3．2 细胞膜感应蛋白Sho1研究进展

4本论文研究目的和意义

第二章灰葡萄孢菌细胞膜感应蛋白BcSho1生物学功能研究

1材料与方法

1．1供试菌株及质粒

1．2供试试剂及培养基

1．3 DNA和RNA的提取

1．5 BcSho1基因敲除及GFP回复标记

1．6 BcSho1基因敲除突变体表型测定

2结果与分析

2．1灰葡萄孢菌中BcSho1基因序列鉴定与分析

2．2灰葡萄孢菌BcSho1基因敲除突变体和BcSho1基因去掉跨膜区回复突变体的生物学特征

3 讨论

参考文献

第三章灰葡萄孢菌BcSln1生物学功能及与BcSho1协同作用研究

1材料与方法

1．1供试菌株及质粒

1．2供试药剂培养基

1．5灰葡萄孢菌BcSln1基因敲除

1．6灰葡萄孢菌BcSln1和BcSho1基因双敲除

1．7 BcSln1基因敲除突变体、BcSln1和BcSho1双敲除体表型测定

2结果与分析

2．1 灰葡萄孢菌中BcSln1基因序列鉴定与分析

2．2灰葡萄孢菌BcSln1基因敲除突变体及BcSln1和BcSho1基因双敲除的生物学特征

3讨论

参考文献

全文小结

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢