水稻种子休眠QTLs动态分析和种子吸胀相关基因鉴定

摘要

水稻（Oryza sativa L.）是中国最重要的粮食作物，随着经济的快速发展，人口的增加，人民生活水平的提高，如何持续增加中国水稻产量，改进稻米品质对中国粮食安全，繁荣稻米市场具有重要意义。水稻穗发芽在中国南方和长江中下游稻区的水稻生产上常有发生，穗发芽不仅影响水稻产量和稻米品质，对下一季水稻种子的活力也有严重影响，穗发芽的发生给农民造成严重的经济损失。因此，培育具有适度休眠特性的水稻品种对中国水稻生产以及种子产业发展具有重要意义。近年来，机栽和直播等水稻轻简栽培方式在中国南方稻区发展迅速，水稻轻简栽培对水稻种子活力有较高的要求。以往研究表明，种子引发处理能有效提高种子活力。目前，对水稻种子引发的最佳时间缺少研究，开发水稻种子引发生物标记，可以监测种子引发进程，为高活力水稻种子生产和种子引发处理提供理论依据。本论文利用一个籼粳稻杂交衍生的重组自交系群体，分析水稻种子不同发育阶段休眠QTLs，并鉴定水稻种子吸胀关键基因。主要研究结果如下: 1、利用粳稻地方品种韭菜青和籼稻品种IR26杂交后衍生的一个由150个家系组成的重组自交家系(RILs，Recombination inbreeding lines)群体，在水稻种子三个不同发育时期（抽穗后4、5、6周）开展种子休眠性动态QTLs分析。籼稻IR26的种子休眠性显著强于粳稻韭菜青;随着种子发育进程的推进，亲本和RILs群体种子的休眠性均呈逐渐下降的趋势;RILs群体不同家系的种子休眠性呈连续偏态分布，大部分具有强休眠性，偏向于亲本IR26。分析种子休眠性与抽穗期、种子发育过程中的环境温度值的相关性，发现抽穗期、环境温度对发育早期（4周）、中期（5周）种子的休眠性影响显著，抽穗期越迟、种子发育过程中的温度越低，种子的休眠性越强。 2、进一步利用QTL IciMapping和Network软件，进行种子休眠性QTLs动态分析，共检测到8个种子休眠性QTLs;分别在种子发育早期、中期和晚期检测到4个(qSD1.1、qSD2.2、qSD4.1、qSD4.2)、1个(qSD5.1)和3个(qSD2.1、qSD3.1、qSD7.1)QTLs;对三个不同发育时期的种子休眠性QTLs进行联合分析，共检测到1个加性QTL和2个上位性QTLs，其中1个上位性QTL与种子发育时期存在互作效应。单个加性QTL、上位性QTL和QTL×发育时期的互作效应分别能解释8.0-13.5％、0.7-3.9％、1.3-2.8％的种子休眠性的表型变异。控制种子休眠性的主效QTL qSD7.1与抽穗期相关Q TL qHD7.4之间存在紧密连锁关系。与以往报道的水稻种子休眠QTLs物理位置进行比较，本研究检测到的5个种子休眠性QTLs，qSD1.1、qSD2.1、qSD2.2、qSD4.1、qSD4.2可能是新位点。 3、根据QTL定位结果，从重组自交系群体不同家系中选择具有最多优异等位基因的材料，筛选获得的4个优异家系，分别为:RIL37、RIL55、RIL67和RIL72。这些RILs含有3～7个控制种子休眠性的增效等位基因，预测了3个可以改良种子休眠性的最佳杂交组合RIL37×RIL72、RIL37×RIL67、RIL55×RIL72，其能聚合8个优异等位基因。本研究筛选到的适度休眠性优异RILs材料，以及定位的种子休眠相关QTLs位点为后期利用分子标记辅助选择方法改良水稻种子休眠性提供基础。 4、种子吸胀第Ⅱ阶段（种子吸水24h）是决定种子引发处理效果的关键时期。本研究以粳稻地方品种韭菜青为材料，利用双向凝胶电泳技术鉴定与水稻种子吸胀第Ⅱ阶段相关的基因。以干种子为对照，在吸胀24h的种子中鉴定到差异倍数＞2、P＜0.01水平显著差异表达的14个蛋白点;成功鉴定到9个种子吸胀相关蛋白，包括葡萄糖磷酸化腺苷基转移酶、氨基酸转移酶、淀粉合成酶、热激蛋白(Hsp20)、醇溶谷蛋白、FAD-依赖氧化还原酶、磷酸甘油酸激酶、伸长因子Tu、氨基转移酶Ⅰ和Ⅱ结构域。GO分析表明，这些吸胀相关蛋白属于碳水化合物类、生物合成类、代谢相关、信号传导相关、贮藏蛋白和逆境相关蛋白。利用水稻基因芯片公共数据库分析，发现这些编码蛋白的基因主要在种子灌浆、成熟期表达以及胚乳组织中表达。进一步利用qRT-PCR分析了水稻种子引发0～48h的基因表达，发现与胁迫相关的基因在吸胀早期表达，与碳水化合物代谢、蛋白质合成、信号传导相关基因在吸胀后期表达;其中，;葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶、氨基转移酶和醇溶谷蛋白等三个蛋白的基因表达水平和蛋白含量变化一致，可进一步开发成水稻种子引发生物标记。 5、对上述鉴定的一个种子吸胀相关热激蛋白(Hsp20)进行功能验证，利用生物信息学技术和PCR技术克隆了OsHsp20的全长基因。比对不同支取Hsp20氨基酸序列发现OsHsp20与单子叶植物的同源性高于与双子叶植物的同源性;OsHsp20基因组织表达分析表明，其在穗部的表达量最高，在茎节的表达量其次。以粳稻中花11为受体构建了OsHsp20过量表达和干涉抑制表达的转基因植株，OsHsp20RNAi干涉和过表达转基因株系种子第2d的发芽率与野生型相比，分别显著降低和升高，初步验证了该基因能调控水稻种子发芽速度。

目录

声明

摘要

缩略词及英汉对照

第一章作物种子休眠生理与遗传研究进展

1种子休眠意义

2种子休眠的类型

3种子休眠的原因

4种子休眠破除方法

5种子休眠的调控

6种子休眠QTLs定位

第二章作物种子萌发生理与遗传研究进展

1种子萌发过程

2种子萌发的调控

2．1内源激素

2．2蛋白质

2．3其他化学物质

2．4温度

2．5光

3引发处理对种子萌发的调节

3．1种子引发意义

3．2种子引发方法

3．3种子引发的影响因素

3．4种子引发机理

4种子萌发的蛋白质组分析

4．1蛋白质组学技术研究进展

4．2种子蛋白组学研究进展

5热激蛋白研究进展

6本研究目的与意义

第三章水稻种子不同发育时期休眠性QTLs的动态分析

1材料和方法

1．1试验材料及田间种植

1．2种子休眠性鉴定

1．3图谱构建

1．4 QTL定位

1．5优异家系材料鉴定

1．6优异亲本杂交组合预测

1．7数据分析

2结果与分析

2．1亲本和重组自交系群体的种子休眠

2．2相关性分析

2．3 QTL定位

2．4上位性QTL及QTL×发育阶段互作分析

2．5主效QTL qSD7．1分析

2．6优异亲本杂交组合预测

3讨论

第四章蛋白质组学技术鉴定水稻种子吸胀相关基因

1材料与方法

1．1植物材料与田间种植

1．2发芽试验

1．3总蛋白质提取

1．4双向电泳分析

1．5质谱分析

1．6蛋白质功能分析

1．7种子引发处理

1．8 Real-time PCR

1．9 OsHsp20基因组织表达分析

1．10 OsHsp20基因克隆

1．11转基因载体的构建与鉴定

1．12转基因水稻的构建

1．13数据分析

2．1种子萌发表型

2．2差异蛋白鉴定

2．3蛋白功能分类

2．4基因表达Meta分析

2．5种子吸胀过程基因表达分析

2．6种子引发生物标记开发

2．7 OsHsp20基因的克隆及序列分析

2．8 OsHsp20氨基酸序列比较及系统进化分析

2．9 OsHsp20基因组织表达分析

2．10 OsHsp20基因的转基因株系构建

2．11 OsHsp20的转基因株系表型鉴定

3讨论

全文总结和创新点

一、全文总结

二、创新点

不足之处和下一步计划

一、不足之处

二、下一步计划

参考文献

附录

在读期间发表或待发表的论文

致谢