棉花、甜菜直接器官发生植株再生及转基因的研究

摘要

作为世界性重要经济作物的棉花，由于其生长发育期恰好与各种自然灾害的频发季节相重叠，因此对棉花品种性状的要求显得比其他任何作物都复杂，传统的棉花育种方法发展到今天面临着种质资源贫乏、远缘杂交困难等问题，这就使有益性状的结合，尤其是高产、优质、多抗性状的有机结合十分困难。利用遗传工程技术改良棉花品种的研究越来越受到科学研究者的关注。然而目前棉花生物技术的发展仍然存在着很多障碍，如棉花体细胞胚胎发生的基因型依赖性、棉花组织培养的低效性(耗时、耗工)、基因转化技术的复杂性(难重复，转化率低)和转基因棉花的农艺性状的变异等等，这些问题已经成为棉花生物技术、棉花功能基因的验证和棉花相关基因克隆等研究领域的障碍和瓶颈。
　　 甜菜是重要的糖用和饲料作物，糖用甜菜提供了全球约30％的食糖；饲料甜菜是家畜最佳的多汁饲料，块根肥大，营养丰富。由于栽培驯化时间较短，加上它又是一种2年生的异交作物，遗传背景狭窄，资源贫乏。特别是自交高度不亲和性，往往使得优良单株基因型很容易丢失，给优良品种选育材料的繁殖和保存带来了极大困难。现代生物技术的发展给甜菜育种方法开辟了一条新途径。然而，由于甜菜组织培养重复性差，愈伤组织难以诱导，植株再生受基因型限制，这些问题严重影响到植物基因工程技术在甜菜育种上的实际应用，加剧了传统育种方法的局限性，导致我国糖甜菜与甘蔗糖竞争中处于极大劣势，种植面积大幅度减少，产业的发展面临严峻考验。
　　 为此，本项研究拟通过对棉花、甜菜作物的茎尖、子叶节、上胚轴、茎节等外植体诱导直接器官发生植株再生及转基因的研究，解决棉花、甜菜离体培养植株再生严重依赖基因型且周期长、畸形率高、基因转化率低等问题，为构建农杆菌介导基因转化的技术平台奠定基础，为优良材料的繁殖、保存提供技术支撑，为植物器官发育研究建立较好的实验模型。研究内容包括六大部分：棉花茎尖离体培养植株再生及遗传转化的研究；棉花子叶节离体培养植株再生的研究；棉花上胚轴离体培养植株再生的研究；甜菜品种(系)基因转化和再生体系的建立；甜菜离体培养直接器官发生植株再生的研究；甜菜茎节多芽形态发生的研究。取得的主要研究成果如下：
　　 1、棉花茎尖分生组织是最适合用于植株再生和繁殖的，其再生系统是理想的基因转化受体系统，但再生效率较低，每个茎尖只能再生一个植株。
　　 2、建立了陆地棉、海岛棉子叶节离体培养直接植株再生的技术，这是国内首次将子叶节外植体用于棉花离体培养植株再生的研究。研究结果表明：海岛棉与陆地棉子叶节诱导多芽发生再生植株种间差异明显，海岛棉子叶节诱导多芽植株再生比较容易，陆地棉子叶节诱导多芽植株再生相对困难，但种内不同品种间的差异不明显，即品种间不存在基因型限制。另外，摸索出一种棉花再生芽高效生根培养基配方，海岛棉与陆地棉两棉种的再生芽在生根上也存在较大差异，陆地棉品种再生芽生根率为72％，海岛棉生根率最高可达到90％以上。
　　 3、从对棉花茎尖和子叶节直接再生植株研究获得启示，以及根据植物发育的分子遗传学特点，通过采用有效抑制顶端优势的处理，建立了棉花上胚轴及斩首上胚轴外植体离体培养直接多芽发生植株再生的技术，达到不依赖基因型、简单、快速的效果。该项技术已经申请了国家专利。
　　 4、建立了甜菜子叶节等外植体离体培养植株再生及转基因的技术，寻找到一种高效生根培养基1/2MS+IBA3mg/L+1％蔗糖，生根率可达90％以上，根系粗状、发达，移栽易成活。并利用农杆菌介导法对甜菜子叶节进行了转外源基因的研究，获得了PCR检测阳性植株。该项成果作为主要创新点获得新疆维吾尔自治区2005年度科学技术进步一等奖。
　　 5、根据甜菜特有的丛生生长习性，提出了茎节外植体的概念，并用其建立了离体培养补依赖基因型直接多芽发生植株再生的技术，再生芽诱导率明显高于子叶节外植体。并利用农杆菌介导法对甜菜茎节进行了转外源基因的研究，获得了PCR检测阳性、Southernblot鉴定外源基因整合到甜菜染色体上的植株。
　　 6、观察了甜菜茎节多芽的起源和形态发生，结果表明：茎节外植体从培养的第三天，在叶腋的表皮或表皮下1～2层细胞开始分裂，到第五天已形成了小凸起，第七天可以看到2个芽(平面切片图)，即器官原基是在外源激素作用下重新形成的，并能分裂产生多个。
　　 综上所述，本研究所用棉花的外植体从茎尖到子叶节再到上胚轴及斩首上胚轴，这些外植体在组织结构上密切相关，仅是发育阶段不同，但在对不同生长时期的顶端分生组织区采取有效抑制顶端优势的处理后，可以实现打破基因型限制瓶颈的目标，增强多芽产生的可重复性、可操作性，从而使棉花组织培养植株再生的技术更加完善，对利用基因工程遗传改良棉花品种综合性状和生产的深入意义重大。
　　 本研究根据甜菜营养生长丛生的特点和植物发育的理论，利用茎节作外植体建立了不依赖基因型、重复性好、操作简单、变异率小的高效植株再生技术平台，克服了甜菜植株再生的诸多困难，为遗传工程技术在甜菜育种上的实际应用奠定了基础。与此同时，通过对甜菜离体培养芽形态发生的观察，揭示甜菜茎节芽器官原基是在外源激素的作用下重新形成的，并分裂增殖形成多芽，为甜菜离体培养多芽发生提供了科学依据，为提高甜菜遗传转化的效率、降低嵌合体率具有较大的指导意义，更为建立甜菜遗传转化技术平台奠定了坚实的技术基础。