盾叶薯蓣细胞培养工艺优化及结构动力学模型的初步研究

摘要

盾叶薯蓣(Dioscoreazingberensis C.H.Wright)是我国特有的、具有重要经济价值的药用植物，其次生代谢产物薯蓣皂甙元(diosgenin)是合成甾体激素类药物最重要的前体。为了解决薯蓣资源日渐枯竭的问题，近年来人们尝试使用植物细胞培养技术，大规模培养薯蓣细胞以生产薯蓣皂甙元。但目前的研究仅停留在摇瓶或小试阶段，对培养过程中的动力学研究较少，培养过程中遇到的许多问题仍机理不明，离工业化还有很大的距离。
　　 本文在摇瓶培养条件下，通过对盾叶薯蓣细胞悬浮培养体系选择培养基种类、添加真菌诱导子、优化培养基成分等方法，得到较优的培养条件和较高的薯蓣皂甙元产率。然后在优化的培养条件下，对培养过程中培养基中的碳源、氮源、磷酸盐浓度进行了测定和分析；研究了细胞鲜重、干重、存活率以及薯蓣皂甙元产量的变化情况；在对反应机理做适当探讨和假设的基础上，建立了盾叶薯蓣细胞悬浮培养动力学结构模型。结论归纳如下：
　　 (1)MS培养基是盾叶薯蓣细胞悬浮培养的最适培养基；添加诱导子真菌RE0105使薯蓣皂甙元产量提高了16.8％；进一步优化培养基成分，当KH2PO4204mg/L和NH4NO31836mg/L时，产量又提高了19.7％。
　　 (2)在最佳培养基条件下，盾叶薯蓣细胞悬浮培养周期为14天，单、共培养体系生长情况类似。细胞生长曲线近“S”型，细胞经历了正常生长、膨胀、裂解三个阶段。薯蓣皂甙元只在2～6天合成，产物合成为生长部分相关型。培养基中碳源和氮源的吸收与细胞生长紧密相关。对细胞的得率系数分别为单培养YX/C=0.476g·g-1 YX/N=3.7041g·g-1；共培养YX/C’=0.4528g·g-1、YX/N’=3.332g·g-1。培养基中磷酸盐的吸收不与细胞生长同步，但胞内磷的消耗与细胞的生长同步。
　　 (3)基于以上研究，运用解释结构模型法，建立了盾叶薯蓣细胞悬浮培养动力学结构模型。在Matlab7.0中运用遗传算法与fminsearch函数相结合获得较精确的最优化参数。最终模型为：
　　 (5)该模型能够很好的模拟细胞培养2～10天内的动力学特性，反应薯蓣皂甙元只在2～6天合成的产物积累特征，但模型对延迟期和限制性底物缺乏的衰亡期预测能力较差。其原因为培养周期内细胞的生长和代谢速率是不一样的，而模型中反应培养过程生理生化特征的参数和细胞对限制性培养基的得率系数却用的定值。2～10天是细胞培养的对数期和稳定期，体系的生长和代谢速率比较稳定，模拟效果较好；而0～2天和10天以后的速率变化比较大引起模型模拟效果不佳。