FasL基因修饰树突状细胞对大鼠同种异体移植免疫耐受诱导的实验研究

摘要

目的:探讨FasL基因修饰的供体树突状细胞(DC)对大鼠同种异体移植免疫耐受诱导的效果，从而为该基因治疗方法应用于器官移植的临床提供依据。 方法: 1.SD大鼠骨髓干细胞体外定向诱导扩增培养DC：无菌手术取大鼠双后肢的胫骨和股骨，髓腔冲洗液经大鼠淋巴细胞分离液梯度离心，分离出界面单个核细胞，用RPMI-1640完全培养基、rr-GM-CSF和rr-lL-4于37.0℃，5％CO2的培养箱中定向诱导培养，隔天半鼍换液并加入rr-GM-CSF和rr-IL-4，每天倒置显微镜进行观察，培养六天、十四天后分别收集细胞进行实验。 2.携带FasL基因的重组慢病毒载体感染DC：培养六天的细胞用不含抗生素，含10％FBS的RPMI-1640培养基重铺于六孔板中，每孔细胞数为5×105个，24小时后观察细胞状态，状态好，按照MOI=5感染细胞，感染24小时后，每孔添加1ml新鲜培养基，继续培养，荧光显微镜下观察细胞的荧光强度和数量，感染10天后行细胞和动物实验。 3.实验动物分对照组、未修饰DC组、FasL基因修饰DC组三组；FasL感染的DC以2×106个/只经尾静脉注入受鼠体内，5天后行皮肤移植，移植后5天部分受鼠移植皮肤送病理检测，其余观察皮肤存活时间，TUNEL法检测移植皮肤淋巴细胞的调亡情况。 结果: 1.骨髓法分离的单个核细胞培养六天后，倒置显微镜可见未成熟DC的形态，培养十四天后行同种混合淋巴细胞反应(MLR)，DC能刺激初始T细胞进行增殖。 2.携带FasL基因的重组慢病毒载体感染DC八天后，细胞开始出现绿色荧光，10天后感染效率可达80％，同种混合淋巴细胞反应(MLR)中能抑制初始T细胞增殖。 3.对照组、未修饰DC组及FasL基因修饰DC组大鼠移植皮肤存活时间分别为(6.44±0.53)d、(7.19±0.37)d、(17.63±2.34)d，经统计学处理，未修饰DC组与对照组之间无显著性差异，而FasL基因修饰DC组与对照组之间有明显差异；病理切片示：FasL基因修饰DC组炎性细胞浸润较对照组和未修饰DC组少，TUNEL检测示：FasL基因修饰DC组移植皮肤可见淋巴细胞凋亡(细胞核呈现黄褐色)。 结论: 1.SD大鼠骨髓造血干细胞体外定向诱导扩增DC成功。 2.携带FasL基因的重组慢病毒载体成功感染DC。 3.慢病毒介导的FasL基因修饰的供体DC预处理受体(经尾静脉注入)，可明显延长移植皮肤的存活时间。

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材料和方法

1.材料

2.方法

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结论

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参考文献

FasL与组织免疫耐受

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