大鼠远位触液神经元标记方法学改进及其P物质与炎性痛的关系

摘要

目的: 为标记远位触液神经元(the distal cerebrospinal fluid contacting neuron，dCSF-CN)提供新的技术方法学；证实P物质(Substance P，SP)在dCSF-CN的表达；探讨dCSF-CN的SP表达与炎性痛的关系。 方法: 实验分两部分。 第一部分：大鼠远位触液神经元标记方法学改进。SPF级SD雄性大鼠，体重290～310g，1％戊巴比妥钠(40mg.kg-1)腹腔注射麻醉成功后立体定位(Brega：-1.2±0.4 mm，Deep：3.2±0.4 mm，Right to median sagittal plane：1.4±0.2 mm)，左侧侧脑室注射CB-HRP 3μl(0.3mg/ml)逆行示踪标记dCSF-CN；保持动物存活，48h后灌注取材后固定，分别用四甲基联苯胺-钨酸钠(TMB-ST)的呈色反应及二甲基联苯铵-氯化钴(DAB-Co)稳定(TMB-ST-DAB-Co法)、CB-HRP免疫荧光及免疫电镜法进行比较标记远位触液神经元；用普通光镜、激光共聚焦显微镜及透射电镜镜检，观察标记结果。 第二部分：大鼠远位触液神经元P物质与炎性痛的关系。此部分分为两个实验： 实验1.颌面部福尔马林致痛大鼠远位触液神经元和三叉神经脊束核P物质的表达：SD雄性大鼠(SPF级，290～310g)12只随机分成两组，每组6只。1％戊巴比妥钠(40 mg.kg-1)腹腔注射麻醉，侧脑室注射30％CB-HRP 3μl逆行示踪标记dCSF-CN：动物存活48h后在右上唇鼻侧中线旁开1.5cm注射2.5％甲醛50μl(实验组)或生理盐水50μl(对照组)进行颌面部福尔马林致痛模型行为学实验，观察抓擦注射部位的时程；2h后灌注取材后固定，免疫组织化学光镜镜检及免疫电镜镜检P物质在三叉神经脊束核(spinal trigerninalnucleus，STN)和dCSF-CN的表达。 实验2.鞘内注射左旋布比卡因对甲醛炎性痛大鼠SP在脊髓背角及远位触液神经元表达的影响。采用CB-HRP大鼠侧脑室注射示踪标记dCSF-CN：48h后先鞘内注射0.5％左旋布比卡因10μl(levobupivacaine，LB；批号0611010132，江苏恒瑞，人工脑脊液稀释；对照组鞘内注射10μl人工脑脊液)，大鼠左后掌足跖部皮下注射2.5％甲醛建立炎性痛模型，记录大鼠舔足时间，1h后测定机械缩足阈值(Mechanical withdrawal threshold，MWT)，评估机械痛敏；免疫组织化学光镜镜检及免疫电镜镜检P物质在脊髓背角(L4-5)及dCSF-CN的表达。用专业图像分析软件(Image-Pro Plus Version 6.0，Media Cybernetics，Inc.)定量分析免疫组化切片，并用SPSS v.13.0(SPSS，Chicago，IL)统计结果。 结果: dCSF-CN是脑干内的一类特别的神经元，其胞体位于室管膜内的脑实质、突起伸入脑室腔的脑脊液。实验结果如下： 1.1 用TMB-ST-DAB-Co法普通光镜镜检，CB-HRP标记阳性神经元的胞体和突起呈黑色颗粒状，主要相对集中地对称分布于中脑导水管的腹侧至脑桥上段第四脑室底的脑实质内，分为三个神经细胞簇； 1.2 采用FITC间接免疫荧光标记CB-HRP阳性神经元在上述脑区见到绿色荧光标记的dCSF-CN的胞体和突起，但细胞核不显色，提示CB-HRP免疫反应阳性产物位于胞浆和突起； 1.3 CB-HRP/SP胶体金双标记免疫电镜程序观察dCSF-CN超微结构，电镜1μl半薄切片制片光镜镜捡dCSF-CN呈赤褐色；电镜视野下CB-HRP免疫反应产物呈现特征性的聚集性杆棒状结晶样结构，出现在dCSF-CN的突起和核周胞浆膜性结构如溶酶体样结构、内质网及高尔基复合体，但核内未见分布；室管膜上皮的免疫反应产物仅出现于室管膜的表面，不能透过室管膜上皮。胶体金标记SP呈高密度颗粒状电子致密物，在酶标dCSF-CN规律性分布，主要集中于突起和胞浆内的膜性细胞器如内质网、高尔基复合体、溶酶体，但线粒体内缺如，核内未见金标颗粒。 2.1 正常状态下大鼠远位触液神经元有SP的表达，在疼痛刺激下表达明显增多；颌面部注射福尔马林诱导的急性炎性痛显著上调SP在dCSF-CN和STN的表达，并与其行为学表现相一致(P<0.01)。 2.2 鞘内注射左旋布比卡因减少大鼠福尔马林试验的舔足时间(P<0.01)，实验组MWT值无变化(与基础值对比，P>0.05)，但对照组MWT值明显减小(与基础值及实验组对比，P<0.01)；SP在脊髓背角及dCSF-CN的表达弱于对照组(P<0.01)。免疫电镜超微结构分析：胶体金标记SP呈颗粒状，在神经元和胶质细胞均有表达；实验组dCSF-CN免疫金标SP较对照组显著减少(P<0.01)；实验组脑干内dCSF-CN分布区电镜下可见较多凋亡细胞而对照组未见。 结论: TMB-ST-DAB-Co法、CB-HRP免疫荧光及免疫电镜程序这三种标记dCSF-CN的方法学值得信赖，但后两种创新的方法在双标dCSF-CN时更有优势；正常状态下SP在大鼠dCSF-CN有表达，炎性痛刺激后SP表达增多；鞘内注射左旋布比卡因减低脊髓伤害性疼痛反应及下调SP在dCSF-CN的表达；提示SP能阳性dCSF-CN在伤害性疼痛处理中可能扮演重要角色；电镜镜检临床麻醉浓度的国产左旋布比卡因鞘内给药后可引起大鼠dCSF-CN分布区神经元的凋亡，确切原因有待进一步研究。

目录

论文说明：缩略词表

声明

第一部分：大鼠远位触液神经元标记方法学改进(中文)

前言

材料和方法

1材料

2方法

结果

讨论

第一部分：大鼠远位触液神经元标记方法学改进(英文)

第二部分大鼠远位触液神经元P物质与炎性痛的关系

前言

实验1.颌面部福尔马林致痛大鼠远位触液神经元和三叉神经脊束核P物质的表达

材料和方法

结果

实验2鞘内注射左旋布比卡因对甲醛炎性痛大鼠SP在脊髓背角及远位触液神经元表达的影响

材料和方法

结果

讨论

结论

论文图片

参考文献

英文综述：触液神经元系统可调节中枢非突触化学信息传递

综述：超声技术引领临床麻醉技术革新

综述二：脑损伤后重症监测治疗新进展

（临床科研）培训总结

临床研究论文：传统阻力消失技术与超声引导硬膜外穿刺的比较

攻读硕士学位期间发表学术论文题目

致谢