一种新的家蚕生殖障碍突变的鉴定与基因定位

摘要

家蚕(Bombyx mori)作为重要经济昆虫和鳞翅目昆虫模式,其突变体是生理学、遗传学、功能基因组学等研究宝贵资源,现已保存有600余种稳定的天然突变体,已有300多个突变性状被定位到了230多个位点上。家蚕基因组精细图的完成以及SSR、SNP分子标记定位技术的日趋成熟,为重要突变性状的图位克隆奠定了基础,家蚕性别决定与生殖、发育变态、抗性、经济性状相关的功能基因的精细定位与克隆鉴定研究已成为近期的研究热点,并取得了瞩目的进展。
　　但在家蚕性别发生与生殖发育领域研究取得的进展缓慢,最重要的原因是家蚕有关性别发生与生殖发育方面的遗传材料缺乏。
　　家蚕性别决定与生殖与果蝇、线虫等模式生物的差异较大,家蚕生殖相关的突变也鲜见报道,因此家蚕性别决定与生殖的分子机制研究进展缓慢。本课题以本团队首次发现的一种两性均表现生殖障碍的自然突变品系为材料,综合应用解剖学、组织化学、遗传学、分子生物学等研究方法,分析其性状遗传规律,生殖系统的结构和组织变化特性,对突变基因进行了分子标记连锁和精细定位分析。研究内容及主要结果如下:
　　一、家蚕生殖障碍突变的发现与遗传分析
　　2007年春蚕期在保育的实用品种皓月(鲁系)出现高比例的不产卵雌蛾,初步解剖发现所有不产卵雌蛾体内均无成熟的蚕卵。采集同蛾区的3头雄蛾与皓月(镇系)品系进行杂交至F2群体中出现不产卵雌蛾的分离。经10代以上同蛾区交配建立了家蚕生殖障碍突变系。
　　经过同一对亲本所产生的45蛾区的F2群体的遗传分析表明,突变性状受1个隐性基因控制,纯合隐性个体表现为雌蛾无卵、雄蛾不能使交配雌蛾产出受精卵。该突变基因可以通过携带隐性突变基因的杂合子个体进行遗传传递。
　　二、家蚕生殖障碍突变的解剖学与组织化学分析
　　野生型品种家蚕卵巢管随着幼虫期发育而变长,同时伴随着卵子及卵室的发生和发育,在突变品系的部分个体发现卵巢管内没有卵子发生以及卵室形成,其卵巢管的伸长受到明显抑制。对野生型品系母蛾产卵后的卵管和突变型雌蛾的卵巢制作切片进行观察,野生型与突变型品系的卵巢的细胞及组织结构并未发现明显差异,因此可初步推断无生殖细胞突变型个体的雌蚕卵子发生、迁移或分化阶段的异常可能是主要原因。
　　雄蚕精巢及雄蛾雌雄内部生系统未见明显的形态差异。切片观察表明在野生型品种的化蛹2d-3d的精巢中每个精巢小室内充满发育中的精子束,而在突变系的精巢中,精巢小室内呈空腔状,没有发现精子束的存在。野生型品系雄蛾的贮精囊内存在大量精子束,而突变体贮精囊内未能发现精子束的存在。可以认为突变型雄蛾个体不能使交配雌蛾正常产受精卵的原因是因为不能产生精子所致。
　　因此,将本实验研究的家蚕生殖障碍突变命名为家蚕无生殖细胞突变(mutation of non-germ-cell, ngc)。
　　三、生殖障碍突变基因ngc的连锁与定位分析
　　由生殖障碍突变品系皓月作为母本,野生型品种大造(p50)作为父本组配F1和F2,收集表现突变表型的雌蛾和雄蛾F2个体285头作为连锁分析和定位分析群体,利用377测序仪和高分辨率熔解分析(HRM)技术进行连锁分析和精细定位。连锁分析的结果表明,无生殖细胞突变性状是由单个隐性基因控制,决定该突变性状的ngc基因位于第17连锁群上。
　　绘制出了家蚕 ngc基因的分子标记连锁图,连锁图的遗传距离为29.7cM, Z17149和Z17S标记与ngc距离最近,均为0.4cM。,Z17149标记和Z17S标记分别对应于家蚕基因组 nscaf2865:4957849_4958073(+ strand)和nscaf2865:5096445_5096643(+strand),两者间的物理距离为138kb。
　　四、定位区域的候选基因预测
　　精细定位确定的138kb区域内有2个预测基因 BGIBMGA007134-TA和BGIBMGA007135-TA,编码的蛋白分别与与果蝇(Drosophila melanogaster)的D-Axin及埃及伊蚊(Aedes aegypti)的体轴抑制蛋白(axis inhibition protein, axin)高度同源。这2个预测基因的CDS间只有1233bp的间隔,根据两者序列设计引物进行RT-PCR并对产物进行序列测定分析证明,两者实际上是同属一个基因,编码家蚕的Axin蛋白。
　　Axin在Wnt信号转导中途径发挥多重功能,Wnt信号转导途径在细胞增殖、分化、运动、黏附及机体发育等过程中起着重要调节作用。上述结果暗示了家蚕无生殖细胞突变可能与家蚕Axin蛋白及Wnt信号转导途径有关。
　　本实验首次尝试利用HRM分析技术对家蚕突变基因进行精细定位,为进一步克隆候选基因及其功能分析奠定了基础,也为研究家蚕表型性状和基因位点间的联系提供了新的高效技术平台。
　　本研究所获得的结果将有助于进一步利用该突变分析家蚕精子和卵子发生发育过程相关的机制,为利用生殖障碍进行害虫种群数量的遗传控制提供靶标基因的信息。

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引言

第1章 绪论

1.1 家蚕突变性状研究

1.2 分子标记的相关研究

1.3 高分辨率熔解曲线分析技术

1.4 家蚕遗传连锁图及基因定位

1.5 本课题的主要研究目标与内容

第2章 家蚕生殖障碍突变的发现与遗传分析

2.1 材料与方法

2.2 实验结果

第3章 家蚕生殖障碍突变的解剖学与组织化学观察分析

3.1 材料

3.2 主要药品、试剂和试验仪器

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

第4章 家蚕生殖障碍突变系无生殖细胞基因的精细定位

4.1 材料

4.2 主要药品、试剂和试验仪器

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 讨论

结论与展望

1 本课题的总结

2 展望

致谢

参考文献