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摘 要
Abstract
第1章 绪 论
1.1研究背景及意义
1.1.1研究背景
1.1.2研究意义
1.2微孢子虫研究进展
1.2.1微孢子虫的超微结构与生活史
1.2.2微孢子虫基因组学与蛋白质组学的研究进展
1.3微孢子虫检测技术研究进展
1.3.1染色法识别微孢子虫
1.3.2免疫学技术检测微孢子虫
1.3.3分子生物学技术检测微孢子虫
1.3.3.1 常规PCR检测微孢子虫
1.3.3.2微孢子虫巢式PCR检测方法
1.3.3.3微孢子虫实时荧光定量PCR检测方法
1.3.3.4 LAMP法检测微孢子虫
1.4纳米金比色法
1.4.1纳米金比色法检测Hg2+
1.4.2纳米金比色法检测核酸物质
1.4.3纳米金比色法检测蛋白质
1.5 SAS-6蛋白质研究进展
1.5.1 SAS-6蛋白质结构研究
1.5.2 SAS-6蛋白质功能研究
1.6研究内容
第2章 应用荧光染色剂Fluorescent Brightener 28和Propidium Iod
2.1实验材料
2.1.1 病原物来源及供试家蚕品种
2.1.2 感染幼虫中肠、母蛾、卵、蚁蚕的获取
2.1.3主要仪器和试剂
2.2实验方法
2.2.1幼虫中肠样品染色
2.2.2母蛾样品染色
2.2.3蚕卵样品染色
2.2.4蚁蚕样品染色
2.3 结果与分析
2.3.1 感染家蚕幼虫中肠的检测效果
2.3.2 感染母蛾的检测效果
2.3.3 感染蚕卵的检测效果
2.3.4 感染蚁蚕的检测效果
2.4 讨论
第3章 纳米金比色法与免疫技术结合检测家蚕微孢子虫
3.1实验材料
3.1.1 微孢子虫
3.1.2主要仪器和试剂
3.2实验方法
3.2.1 纳米金(AuNPs)制备
3.2.2 家蚕微孢子虫总蛋白提取及其抗体制备
3.2.3 抗体与AuNPs结合的最佳pH确定
3.2.4 AuNPs与抗体结合的最佳浓度测定
3.2.5 AuNPs探针制备
3.2.6 纳米金探针活性及其特异性测定
3.2.7 纳米金探针灵敏性测定
3.3 结果与分析
3.3.1 AuNPs的制备
3.3.2 N. bombycis总蛋白抗体制备
3.3.3 最适标记pH和最适抗体量
3.3.4 AuNPs探针活性及其特异性测定
3.3.5 AuNPs比色法灵敏性测定
3.4 讨论
第4章 纳米金比色法与LAMP技术结合检测家蚕微孢子虫
4.1实验材料
4.1.1蚕种
4.1.2 微孢子虫、细菌、真菌和病毒
4.1.3主要仪器和试剂
4.2实验方法
4.2.1 FTA法提取微孢子虫基因组
4.2.2 PCR引物设计、反应体系与反应条件
4.2.3 LAMP引物设计、反应体系及反应条件的优化
4.2.4 纳米金制备
4.2.5 AuNP探针制备
4.2.6 AuNP与LAMP产物杂交条件优化
4.2.7比较LAMP-AuNP法和PCR法检测的灵敏度
4.2.8 LAMP-AuNP法特异性分析
4.2.9 LAMP-AuNP法与PCR法检测带毒蚕卵
4.3结果与分析
4.3.1 LAMP反应温度优化
4.3.2 LAMP反应时间优化
4.3.3 LAMP反应引物特异性分析
4.3.4 LAMP产物与AuNP探针杂交比例优化
4.3.5 盐浓度对比色实验影响
4.3.6 LAMP-AuNP 和PCR法灵敏度比较
4.3.7 LAMP-AuNP法特异性检测
4.3.8 LAMP-AuNP法检测带毒蚕卵
4.4 讨论
第5章 家蚕微孢子虫SAS-6蛋白鉴定及其定位研究
5.1实验材料
5.1.1 家蚕微孢子虫
5.1.2 主要仪器和试剂
5.2实验方法
5.2.1 家蚕微孢子虫DNA提取
5.2.1 家蚕微孢子虫SAS-6基因克隆
5.2.2 NSAS-6蛋白氨基酸序列分析
5.2.3 NSAS-6重组蛋白表达
5.2.4 NSAS-6重组蛋白纯化
5.2.5 Western blot鉴定NSAS-6重组蛋白
5.2.6多克隆抗体制备及其效价检测
5.2.7纯化N.bombycis孢子
5.2.8家蚕微孢子虫总蛋白及孢原质蛋白提取
5.2.9 Western blot检测N. bombycis中NSAS-6蛋白
5.2.10 N. bombycis接种BmN细胞
5.2.11 NSAS-6蛋白亚细胞定位
5.3 结果与分析
5.3.1 NSAS-6基因克隆
5.3.2 生物信息学分析
5.3.3 NSAS-6重组蛋白表达及纯化
5.3.4 NSAS-6蛋白免疫印迹分析
5.3.5 NSAS-6蛋白免疫定位
5.4讨论
结 论
参考文献
附 录
攻读硕士期间发表的学术论文
江苏科技大学;
