桑螟嗅觉相关基因的鉴定、组织表达谱及体外表达的研究

摘要

桑螟Glyphodes pyloalis属鳞翅目Lepidoptera、螟蛾科Pyralidae，是桑树重大害虫之一。由于其生殖周期短、繁殖量大、防治困难，在条件适宜时短期便能暴发成灾，严重影响桑蚕产业持续发展。生产上目前常用的化学防治方法极易导致害虫抗性，产生和引起养蚕中毒，迫切需要研发新的桑螟防治手段。近年来，基于昆虫化学生态学原理，以引诱技术为代表的新型害虫防治手段日益得到重视并不断取得良好的防治效果。本论文在构建桑螟触角转录组数据库的基础上，鉴定桑螟触角中化学感受基因与气味降解酶基因，分析基因的序列特征及系统进化关系，验证代表性嗅觉相关基因的组织表达模式并构建原核表达体系，明确OBPs配体竞争结合特性和GSTs的体外催化活性。 1.利用Illumina测序平台构建了桑螟触角转录组数据库，共获得51,776,602个cleanreads，并拼接出33,461个unigenes，N50值为1968。经blastx相似性分析，这些unigenes与脐橙螟Amyelois transitella相似度最高。从桑螟触角转录组中共鉴定出25个气味结合蛋白基因GpOBPs、4个信息素结合蛋白基因GpPBPs、4个一般气味结合蛋白基因GpGOBPs、20个化学感受蛋白基因GpCSPs、53个气味受体基因GpORs、19个离子型受体基因GpIRs、2个感觉神经元膜蛋白基因GpSNMPs。 2.荧光定量PCR结果表明，20个GpOBPs在桑螟成虫触角中高度表达，推测这些基因可能在桑螟化学信号感受过程中发挥重要作用；11个GpOBPs在桑螟成虫腹部高度表达，2个在桑螟成虫胸部高度表达，推测这些GpOBPs可能在桑螟体内生理活动中发挥作用。GpOBP1、GpOBP10、GpOBP13、GpOBP16和GpOBP21同时在桑螟成虫触角和腹部中表达，且表达具有性别差异性。鉴于GpOBP12和GpPBP1基因在雄性桑螟触角中高度表达，进一步对这2个基因进行体外大量表达和纯化。将这2个基因分别构建到pEASY和pET32a表达载体中，然后在大肠杆菌E.coli中经IPTG诱导表达。分析表明，GpPBP1/pET32a和GpOBP12/pEASY分别在33kDa和18kDa处有一明显加粗带，重组蛋白经HisTrapTMFF crude柱亲和层析得到纯化后的蛋白。体外竞争结合实验表明，重组GpPBP1蛋白对植物挥发物β-紫罗兰酮具有结合能力（IC50=28.7μM；Ki=2.0317μM）。 3.从桑螟触角转录组中鉴定得到18个气味降解酶基因，包括15个谷胱甘肽硫-转移酶基因GpGSTs和3个醛氧化酶基因GpAOXs。其中，GSTs可分为Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta和Zeta6个大类。保守结构域分析表明，8个GpGSTs具有GSH结合域，13个GpGSTs具有底物结合域。荧光定量PCR结果表明，GpGST-D1和3个GpAOXs在雌雄成虫触角中高度表达，推测它们可能参与桑螟触角中气味和信息素的降解过程。GpGST-O1和GpGST-O2在雌成虫触角中的表达量高于其他组织，GpGST-D3在雌成虫腹部的表达量最高，但与雄成虫触角中的表达量无显著差异。除GpGST-D3外，10个GpGSTs（GpGST-D2、GpGSTD4、GpGST-E1、GpGST-E2、GpGST-E3、GpGST-T1、GpGST-Z1、GpGST-S1、GpGST-S2、GpGST-S3）在桑螟成虫腹部的表达量也高于其他组织，但呈现出性别差异性。进一步对GpGST-D1进行体外大量表达和纯化。将该基因构建到pEASY表达载体中，然后在大肠杆菌E.coli中经IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表明，GpGST-D1在25kDa处有一明显加粗带。重组蛋白经HisTrapTMFF crude亲和层析得到纯化后的蛋白。考察了不同温度和pH单因素条件下GpGST-D1重组蛋白的酶学性质，结果表明，在温度为50℃时，酶活达到最高，为44.95±0.67μmol/min/mg；在pH为7.0时，酶活达到最高，为36.68±0.38μmol/min/mg。 在桑螟中开展嗅觉机制研究，不仅有利于揭示不同嗅觉相关基因在桑螟嗅觉体系中的作用和功能，阐明桑螟嗅觉感知的完整过程，也可为桑螟的化学生态学研究提供参考，从而为研发基于嗅觉靶标的新型桑螟防治手段提供支持。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 昆虫的嗅觉感受机制

1.2 昆虫OBPs研究进展

1.3 昆虫其他化学感受基因的研究进展

1.3.1 昆虫CSPs

1.3.2 昆虫SNMPs

1.3.3 昆虫ORs

1.3.4昆虫IRs

1.4 昆虫ODEs研究进展

1.4.1 昆虫触角GSTs

1.4.2 昆虫AOXs

1.5 转录组测序在昆虫嗅觉研究中的应用

1.6研究对象

1.7 研究的目的和主要内容

1.7.1 研究目的和意义

1.7.2 研究内容和技术路线

第2章 桑螟触角化学感受基因的鉴定与序列分析

2.1.材料与方法

2.1.1 供试昆虫

2.1.2 主要试剂与仪器设备

2.1.3 总RNA的提取

2.1.4 桑螟触角cDNA文库的构建和Illumina深度测序

2.1.5 转录组序列的组装和功能注释

2.1.6 桑螟化学感受基因的鉴定及生物信息学分析

2.2 结果与分析

2.2.1 Illumina测序和转录组组装

2.2.2触角unigenes的GO和KOG分类

2.2.3 桑螟化学感受基因的鉴定

2.2.4 GpOBPs序列特征及系统进化树构建

2.2.5 GpCSPs序列特征及系统进化树构建

2.2.6 GpORs序列特征及系统进化树构建

2.2.7 GpIRs序列特征及系统进化树构建

2.2.8 GpSNMPs序列特征及系统进化树构建

2.3 讨论

2.4 本章小结

第3章 桑螟GpOBPs基因的组织表达谱分析及GpPBP1和GpOBP12的原核表达

3.1 材料与方法

3.1.1 供试昆虫

3.1.2 主要试剂及仪器设备

3.1.3 桑螟不同组织的总RNA提取及cDNA链第一链的合成

3.1.4 PCR引物设计

3.1.5 荧光定量PCR反应

3.1.6 原核表达载体的构建

3.1.7 重组蛋白的表达与纯化

3.1.8 重组蛋白His-tag标签的切除和纯化

3.1.9 重组蛋白与气味物质的体外结合实验

3.2 结果与分析

3.2.1 桑螟不同组织中OBPs的表达差异分析

3.2.2 桑螟GpPBP1重组蛋白的诱导表达及纯化

3.2.3 桑螟GpOBP12重组蛋白的诱导表达及纯化

3.2.4 桑螟GpPBP1蛋白与气味物质的结合能力分析

3.3 讨论

3.4 本章小结

第4章 桑螟气味降解酶基因的鉴定、组织表达谱及GpGST-D1原核表达研究

4.1材料与方法

4.1.1 供试昆虫

4.1.2 主要试剂及仪器设备

4.1.3 桑螟ODEs基因的鉴定及生物信息学分析

4.1.4 桑螟不同组织的总RNA提取及cDNA链第一链的合成

4.1.5 PCR引物设计

4.1.6 荧光定量PCR反应

4.1.7 原核表达载体的构建

4.1.8 GpGST-D1蛋白的表达与纯化

4.1.9 GpGST-D1重组蛋白酶活力分析

4.2 结果与分析

4.2.1 桑螟气ODEs基因的鉴定

4.2.2 GpGSTs序列特征及系统进化树构建

4.2.3 GpAOXs序列特征及系统进化树构建

4.2.4 桑螟不同组织中GpGSTs基因的表达差异分析

4.2.5 桑螟不同组织中GpAOXs基因的表达差异分析

4.2.6 桑螟GpGST-D1蛋白原核表达载体的构建与鉴定

4.2.7 桑螟GpGST-D1重组蛋白的诱导表达及纯化

4.2.8 桑螟GpGST-D1重组蛋白酶活力分析

4.3 讨论

4.4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢