感染浓核病毒的家蚕中肠差异蛋白质组学研究

摘要

家蚕浓核病毒中国株(BmDNV-3)是我国蚕业上危害较大的病毒之一，是夏秋季养蚕中的常见病。家蚕中有部分品系对此病毒表现出完全抵抗，经典遗传学分析发现，家蚕对BmDNV-3的抗性产生是由隐性单基因控制的。但其抗性产生的机制目前尚不清楚。本研究运用蛋白质组学的方法研究了浓核病毒感染后家蚕中肠的蛋白表达谱；用差异蛋白质组学的研究方法，比较了不同感受性家蚕品种在病毒感染后的24h、36h和48h中肠组织的差异蛋白；并分析了相关蛋白的基因结构。其结果如下： 1.通过双向电泳技术对感染BmDNV-3后家蚕的中肠组织的总蛋白进行了分离，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MAIDI-TOF/TOF MS、)对表达量较高的蛋白点进行了肽质量指纹图谱分析，并对肽质量指纹图谱进行了数据库比对分析。其结果是：家蚕中肠蛋白质经过双向凝胶电泳和银染后可以检测出280个以上的蛋白点。对其中104个分离的较好的蛋白点进行了MALDI-TOF MS鉴定，这些蛋白点均得到了较强的肽质量指纹信号峰，其中34个蛋白点得到了成功鉴定，包括大量的离子转运蛋白与热休克蛋白等。 2.从不同感受性家蚕品种在病毒感染后各时间段的中肠组织的差异蛋白中获得了部分抗性相关蛋白。总的来说，不同时段得到的差异蛋白虽略有不同，但有一些蛋白在各个时段差异表现比较稳定，这些蛋白是值得重视和研究的蛋白。例如，糖基转移酶在各个时段的抗性品系中的表达量均高于感性品系。该酶是一种细胞膜表面蛋白，与细胞表面蛋白的糖基化有关。这一蛋白表达的差异可能意味着细胞表面蛋白糖基化发生了改变。这与日本学者发现的抗BmDNV-2品系细胞表面蛋白糖基化位点改变，导致宿主对病毒的敏感性发生改变的结果一致。但由于蛋白质的糖基化需要多种糖基化酶的协同作用，此酶可能是蛋白糖基化调控网络中的一个节点蛋白。研究中还发现一些在应激和机体处于高耗能状态时表达升高的蛋白在抗性品系中有较高的表达。这说明，与感性品系相比，抗性品系对于病毒的入侵产生了更强的应激反应，这种增强的应激反应可能在抵抗病毒入侵时起到了一定的防御作用。 3.本实验中发现抗性品系中肠组织中有BmDNV-3 VD1-orf 1基因产物，这一病毒非结构蛋白的发现意味着该病毒确实可以在抗性品系中肠细胞中复制。 4.糖基转移酶的基因分析通过电子克隆对家蚕糖基转移酶基因进行了拼接，并运用并运用生物信息学技术对家蚕糖基转移酶基因进行了初步分析，获得了其保守结构域及与其它物种的进化关系。进化树分析表明，通过电子克隆得到的家蚕糖基转移酶蛋白与其它昆虫的糖基转移酶蛋白进化关系较近，而与其它物种，如哺乳动物和鱼类的亲缘关系较远。

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文摘

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论文说明：缩写与符号

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第一章绪论

1.1家蚕浓核病毒分类地位

1.1.1细小病毒特征及分类

1.1.2浓核病毒分类及特征

1.1.3家蚕浓核病毒特征及分类

1.2家蚕浓核病毒中国株的生物学特征

1.2.1病症特征和组织病变

1.2.2家蚕浓核病毒中国株在蚕业生产中的危害

1.2.3家蚕浓核病的诊断

1.3家蚕对BMDNV抗性研究进展

1.4蛋白质组学研究概述

1.4.1蛋白质分离技术

1.4.2蛋白质鉴别分析

1.4.3蛋白质数据库和蛋白质生物信息学

1.4.4蛋白质组学在昆虫免疫及昆虫抵抗性方面的应用

1.4.5蛋白质组学在病毒与细胞相互作用机理研究中的应用

1.5立题的目的意义

1.5.1目的

1.5.2意义

1.6主要研究内容和目标

1.7技术路线

第二章感染家蚕浓核病毒的家蚕中肠蛋白表达谱

2.1实验材料

2.1.1材料来源

2.1.2仪器与试剂

2.2实验方法

2.2.1样品制备

2.2.2第一向等电聚焦

2.2.3第二向SDS-PAGE电泳

2.2.4凝胶染色

2.2.5图像处理

2.2.6胶内酶切

2.2.7质谱分析

2.3结果及分析

2.3.1表达谱分析

2.3.2中肠蛋白的鉴定

2.3.3鉴定蛋白的分析

第三章家蚕不同感受性品系在感染BMDNV-3后中肠组织的比较蛋白质组学研究

3.1实验材料

3.1.1材料来源

3.1.2仪器与试剂

3.2实验方法

3.3实验结果

3.3.1接种病毒24h后感性和抗性家蚕中肠的二维电泳图谱

3.3.2接种病毒24小时后抗性与感性品系中肠差异蛋白的质谱鉴定与分析

3.3.3接种病毒48h后秋丰和华八35中肠的二维电泳图谱

3.3.4接种病毒48小时后抗性与感性品系中肠差异蛋白的质谱鉴定与分析

3.3.5接种病毒36小时后抗性、感性及近等基因系中肠蛋白表达谱

3.3.6接种病毒36小时后抗性、感性及近等基因系中肠差异蛋白的质谱鉴定与分析

3.3.7本章小结及讨论

第四章家蚕糖基转移酶基因的分析

4.1实验方法

4.1.1电子克隆

4.1.2生物信息学分析

4.2结果与分析

4.2.1序列分析

4.2.2蛋白质推导分析

4.2.3不同物种间GlcAT蛋白同源性比较

4.2.4进化分析

4.3讨论

第五章结论和展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文和参加的课题