家蚕浓核病毒（中国株）非结构蛋白NS3基因的克隆与表达

摘要

家蚕浓核病毒中国株是一种特异的、在我国发生的致使家蚕罹患类似浓核症的病原。它只感染家蚕中肠上皮组织的柱状细胞，其宿主感染后的病症与典型的家蚕浓核病毒(BaDNV-1伊那株)表现相似，病蚕软化，中肠的柱状细胞呈浓核症，但发病后期也感染杯状细胞。BmDNV-3拥有双分子基因组(VD1，VD2)，而且病毒自身编码DNA聚合酶。本试验室完成了对BmDNV-3全基因组序列的测定，但是对病毒复制方式、侵染机理及基因的功能不太清楚。本论文对家蚕浓核病毒(中国株)的NS3基因进行了克隆与分析，分别通过大肠杆菌BL21和家蚕杆状病毒表达系统对该基因做了表达。为分析NS3蛋白与DNA结合以及与其它蛋白互作，阐明非结构蛋白NS3在病毒复制中作用奠定基础。 1.根据BmDNV-NS3基因序列设计特异引物，PCR方法扩增到了一个669 bp的NS3基因，经酶切鉴定，NS3片段连接到了pGEM-T载体上。利用生物学软件对该基因的氨基酸序列特征和同源性分析，结果表明它与JcDNV、GmDNV、MIDNV的NS3蛋白同源性分别达31％、26％、26％，而且含有两个保守序列锌指结构，6个潜在的糖基化位点，4个潜在的磷酸化位点。 2.对家蚕五龄幼虫经口接种BmDNV-3病毒，分不同的时间段提取感染幼虫的中肠组织，提取组织中总RNA，反转录成cDNA。用RT-PCR对BmDNV-3 NS3基因进行半定量分析。结果表明NS3基因在2 h．p.i.开始转录，在36-72.h．p.i.时持续高水平转录，说明NS3蛋白在不仅在病毒基因组DNA复制期间大量表达，参与病毒基因组的复制，而且还可能参与病毒的装配。 3.NS3基因克隆到了大肠杆菌表达载体pET30a的Xho I和BamHI位点中，构建了pET30a-NS3重组载体，阳性质粒转化E.coli BL21，使用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导NS3基因的表达，SDS-PAGE和Western Blotting显示，在30kDa处出现一条特异的蛋白带。质谱分析结果进一步表明表达的融合蛋白是BId)NV的NS3。表达产物经10％SDS-PAGE分离，切取目的条带，将透析获得的目标蛋白，皮下免疫新西兰大白兔，得到了NS3抗血清，SDS-PAGE显示经ProteinA亲和凝胶柱纯化的NS3抗血清效果较好。 4.将基因克隆到杆状病毒转座载体pFastBacHTe的Xho Ⅰ和BamHⅠ位点中，成功构建了pFastBacHTe-NS3重组转移载体。转化至受体菌DH10Bac后，PCR证明EGFP-NS3已成功发生转座。获得的重组Bacmid-EGFP-NS3转染家蚕细胞后，得到了重组病毒rBac-EGFP-NS3。rBac-EGFP-NS3接种五龄家蚕起蚕SDS-PAGE和western blotting分析表明NS3蛋白在家蚕幼虫中得到了表达。

目录

文摘

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论文说明：缩写与符号

声明

第1章绪论

1.1家蚕浓核病毒

1.1.1浓核病毒的分类

1.1.2浓核病毒的特征

1.1.3家蚕浓核病毒Ⅰ型特征

1.1.4家蚕浓核病毒Ⅱ型的特征

1.2家蚕浓核病毒中国株BmDNV-3的研究

1.2.1 BmDNV-3的分类地位

1.2.2 BmDNV-3的病原学研究

1.3家蚕浓核病毒中国株分子生物学研究

1.3.1 BmDNV-3基因组结构特点

1.3.2基因组开放阅读框及编码区分布

1.3.3基因组的末端结构分析

1.3.4可能的启动子区和poly(A)位点

1.4细小病毒非结构蛋白研究

1.4.1细小病毒非结构蛋白研究

1.4.2浓核病毒非结构蛋白的研究

1.5外源基因表达系统

1.5.1原核表达系统

1.5.2杆状病毒表达系统的概述

1.6立题的目的意义

1.7研究内容和技术路线

第2章家蚕浓核病毒(中国株)NS3基因的克隆、序列分析及表达分析

2.1材料

2.1.1主要实验仪器设备

2.1.2主要实验试剂和药品

2.1.3载体、菌株及主要数据库软件

2.2方法

2.2.1引物设计与合成

2.2.2 NS3基因的PCR反应

2.2.3连接反应

2.2.4感受态细胞制备

2.2.5质粒DNA转化

2.2.6 SDS-碱裂解法小量抽提质粒DNA

2.2.7质粒DNA酶切鉴定

2.2.8氨基酸序列分析

2.2.9进化树分析

2.2.10样品制备

2.2.11中肠组织总RNA的提取

2.2.12 NS3基因的RT-PCR检测

2.3结果与分析

2.3.1 NS3基因PCR分析

2.3.2重组质粒酶切鉴定

2.3.3 BmDNV-3 NS3结构分析与预测

2.3.4 NS3蛋白序列同源性比较

2.3.5 NS3蛋白序列进化树分析

2.3.6 BmDNV-3 NS3基因的转录分析

2.4讨论与总结

第3章家蚕浓核病毒中国株NS3蛋白的原核表达及抗体制备

3.1材料

3.1.1主要实验仪器设备

3.1.2主要实验试剂和药品

3.1.3质粒和菌株

3.2方法

3.2.1 NS3基因在大肠杆菌中的表达

3.2.2 Western blot分析

3.2.3质谱分析

3.2.4融合蛋白His-NS3的纯化及多克隆抗体的制备纯化

3.3结果与分析

3.3.1 NS3基因在大肠杆菌中的表达结果

3.3.2 Western Blot检测

3.3.3表达蛋白的质谱分析

3.3.4 His-NS3融合蛋白的回收及多克隆抗体的制备

3.4讨论与总结

第4章家蚕浓核病毒中国株NS3蛋白的真核表达

4.1材料

4.1.1主要实验仪器设备

4.1.2主要实验试剂和药品

4.1.3质粒和菌株

4.2方法

4.2.1 NS3在家蚕细胞中的表达

4.2.2 NS3通过杆状病毒表达系统在家蚕幼虫中的表达

4.3结果与分析

4.3.1 NS3在家蚕细胞中的表达

4.3.2家蚕幼虫中表达NS3蛋白

4.3.3家蚕幼虫中表达产物的SDS-PAGE及Western Blotting分析

4.4讨论与总结

第5章主要工作总结及工作展望

5.1主要总结

5.2工作展望

参考文献

致谢

在学期间发表论文