饲料添加色素在鸡及其蛋中的代谢组学识别初步研究

摘要

禽类及其产品中色素的添加可以发生在食品生产的过程中,也可以发生在饲养的过程中。国家标准对可使用色素的种类和添加剂量都有明确规定。违禁、违规色素在禽类及其产品中的添加不同于天然色素,会给消费者的健康带来一定的风险和危害。现有关于色素的研究以检测分析方法居多,而色素对禽类及其产品中的代谢物的影响尚未见报道。因此寻求一定的生物标示分子,以指示禽类及其产品中色素的来源来评价其安全性,对保障禽产品食品的安全显得尤其重要。本文采用代谢组学研究方法及代谢物组学研究技术,选取天然色素叶黄素和人工合成色素苏丹红Ⅳ作为研究对象,考察两种色素对鸡及其蛋中的代谢物的影响。主要研究内容和结果如下:
　　 1.建立简单、有效的样品前处理方法。称取0.5 g样品于10 mL玻璃离心管中,加入3 mL甲醇进行提取,涡旋混合2分钟后常温超声提取20分钟,以10000r／min速度离心5分钟,取上清液于试管中,将下层沉淀物用3 mL甲醇重复提取,合并收集的上清液(血液样品的前处理方法为:量取1～mL血液样品于离心管中,14000 r／min高速离心5分钟,取上清液)使用山东安得注射器、Ray Fil0.22μm有机滤膜过滤,进样检测。获得了代谢物数目较多、无多聚物干扰的样品提取溶液。
　　 2.建立LC-MS／Q-TOF对鸡及其蛋中的代谢物进行定性检测的分析方法。色谱条件:Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(ψ2.1×100 mm,3.5μm)；流动相为乙腈和0.1％甲酸-水溶液(负离子模式采集时为纯水)；梯度洗脱条件为0 min～17 min内0.1％甲酸-水溶液(负离子模式采集时为纯水)由95％等梯度变化为10％,维持3 min后,由10％恢复到95％；流速0.3 mL／min；柱温40℃；进样量10μL,单个样品运行时间为25分钟。质谱条件:ESI(+／-),干燥气N2,温度350℃,流速10 L／min；雾化气压力241.325 kPa；鞘气温度400℃,流速12 L／min；毛细管电压3500 V；喷嘴电压0 V；碎裂电压175 V；离子扫描范围:50～1000 m／z;正模式的参比离子:121.0855、922.0922,负模式的参比离子:112.9856、1033.9881。在此条件下,可获得较为全面的代谢物信息。
　　 3.研究叶黄素对鸡体及其蛋中代谢物的影响,发现对粪便、鸡蛋、鸡肝、鸡肉样品在LC-MS／Q-TOF正、负离子模式下采集得到的数据进行PCA分析时,空白对照组和添加叶黄素组都能得到明显的区分；而血液样品仅在正模式下得到的数据能使两组得到明显的区分。对发生显著变化(t-test P<0.05,倍数变化>2)的代谢物进行了初步鉴定,发现有机酸(含不饱和脂肪酸)、醇、酯、胺类、氨基酸、维生素等物质发生的变化居多；其中,左旋-18-甲基炔诺孕酮醋酸盐在鸡蛋和鸡肝中都发生了显著变化,3-甲基黄嘌呤等代谢物在鸡肝和鸡肉中都发生了显著变化,可被作为叶黄素代谢的潜在生物标记物进行深入研究；同时,叶黄素还可能对鸡体内原有的部分外源性药物产生了显著影响。结果表明,在蛋鸡饲料中添加的叶黄素,可对鸡体及其蛋中的代谢物产生影响。
　　 4.研究苏丹红Ⅳ对鸡体及其蛋中的代谢物的影响,发现对血液、粪便、鸡蛋样品在正、负模式下的检测结果进行PCA分析时,空白对照组和添加苏丹红Ⅳ组都能得到明显的区分；对发生显著变化(t—test P<0.05,倍数变化>2)的代谢物在数据库中进行了初步鉴定,发现有机酸、醇、酯、氨基酸类等物质发生的显著变化居多；7,11-hexadecadien-1-ol在血液和粪便中都发生了显著变化,1-α,25-二羟基-26,27-二甲基-22,22,23,23-四氢化维生素D3在血液和鸡蛋中都发生了显著变化,可望被确认为对苏丹红Ⅳ具有指示、识别作用的潜在生物标记物进行深入研究；苏丹红Ⅳ也可能对鸡体内原有的部分外源性药物产生了显著影响。结果表明,在蛋鸡饲料中添加苏丹红Ⅳ确实可引起鸡体及蛋内代谢物的变化。

目录

文摘

英文文摘

图表清单

第一章 绪论

1.1 代谢组学概述

1.1.1 代谢组学简介

1.1.2 代谢组学研究方法

1.2 天然色素叶黄素和人工合成色素苏丹红Ⅳ概述

1.2.1 叶黄素

1.2.2 苏丹红Ⅳ

1.3 代谢组学在食品安全领域应用的研究进展

1.4 立题依据与意义

1.5 主要研究内容

第二章 LC-MS/Q-TOF检测分析方法的建立

2.1 引言

2.2 材料与仪器

2.2.1 材料与试剂

2.2.2 仪器与设备

2.3 试验方法

2.3.1 样品前处理

2.3.2 色谱条件

2.3.3 质谱条件

2.3.4 方法学考察

2.4 数据处理方法

2.4.1 数据处理流程

2.4.2 数据分析方法

2.5 结果与讨论

2.5.1 样品前处理

2.5.2 质谱条件的优化

2.5.3 方法学考察结果

2.6 本章小结

第三章 叶黄素对鸡及其蛋中代谢物的影响研究

3.1 引言

3.2 材料与仪器

3.2.1 试验材料

3.2.2 仪器与设备

3.3 动物饲养

3.3.1 笼养安排

3.3.2 添加叶黄素饲料的配制方法

3.3.3 饲养管理与取样

3.4 试验方法

3.5 结果与讨论

3.5.1 叶黄素对血液样品中代谢物的影响

3.5.2 叶黄素对粪便样品中代谢物的影响

3.5.3 叶黄素对鸡蛋样品中代谢物的影响

3.5.4 叶黄素对鸡肝样品中代谢物的影响

3.5.5 叶黄素对鸡肉样品中代谢物的影响

3.5 本章小结

第四章 苏丹红Ⅳ对鸡及其蛋中代谢物的影响研究

4.1 引言

4.2 材料与仪器

4.2.1 试验材料

4.2.2 仪器与设备

4.3 动物饲养

4.3.1 笼养安排

4.3.2 添加苏丹红Ⅳ饲料的配制方法

4.3.3 饲养管理与取样

4.4 试验方法

4.5 结果与讨论

4.5.1 苏丹红Ⅳ对血液样品中代谢物的影响

4.5.2 苏丹红Ⅳ对粪便样品中代谢物的影响

4.5.3 苏丹红Ⅳ对鸡蛋样品中代谢物的影响

4.5 本章小结

第五章 结论与展望

5.1 主要结论

5.2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文

附录