IRAKs在anti-β2gpi/β2GPI复合物诱导THP-1细胞表达TF中的作用探讨

摘要

目的：本课题组前期研究证明,Toll样受体4(TLR4)及相关分子-髓样分化因子88(MyD88)、髓样分化蛋白-2(MD-2)参与抗β2糖蛋白Ⅰ抗体／β2糖蛋白Ⅰ(anti-β2GPI／β2GPI)复合物诱导人单核细胞株THP-1表达组织因子(TF),且部分依赖膜联蛋白Ⅱ(ANX2),成为抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)血栓形成的机制之一。白细胞介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor-associated kinases,IRAKs)是TLRs下游关键信号分子,在天然免疫、获得免疫和一些疾病的发生发展中发挥重要作用。本论文重点探讨IRAKs在anti-β2GPI／β2GPI诱导单核细胞株THP-1细胞表达TF中的作用及其信号转导机制。
　　 方法：①利用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测anti-β2GPI／β2GPI复合物诱导THP-1细胞TF mRNA的表达,采用试剂盒检测细胞TF活性。②采用RT-qPCR及Western蛋白印迹检测anti-β2GPI／β2GPI复合物诱导THP-1细胞IRAK1、IRAK3、IRAK4的表达及IRAK1的磷酸化。③采用IRAK1／4抑制物预处理THP-1细胞,观察其对anti-β2GPI／β2GPI复合物诱导IRAK1、IRAK3、IRAK4和TF的表达及IRAK1磷酸化的干预效应。④利用ANX2 RNA干扰慢病毒(LV-RNAi-ANX2)感染THP-1细胞,验证内源干扰效率,建立ANX2 RNAi细胞模型。⑤采用RT-qPCR及Western蛋白印迹检测anti-β2GPI／β2GPI复合物刺激ANX2 RNAi的THP-1细胞IRAK1、IRAK3和IRAK4的表达及IRAK1的磷酸化情况。⑥采用TLR4／MD2途径抑制物-紫杉醇预处理THP—1细胞,观察其对anti-β2GPI／β2GPI复合物诱导IRAK1、IRAK3和IRAK4的表达及IRAK1磷酸化的影响。
　　 结果：⑴Anti-β2GPI／β2GPI复合物(100μg／ml)能显著增加THP-1细胞TF mRNA水平及TF活性(与未刺激对照比较p<0.05)。⑵Anti-β2GPI／β2GPI复合物(100μg／ml)明显上调THP-1细胞IRAK1、IRAK3和IRAK4表达及IRAK1磷酸化水平(与未刺激对照比较p<0.05)。⑶IRAK1／4抑制物(50μmol／L)对anti—β2GPI／β2GPI复合物诱导的IRAK1和IRAK4表达没有影响,但能够降低IRAK3的表达及IRAK1的磷酸化水平,并且抑制TF的表达(与未经IRAK1／4抑制物处理组比较p<0.05)。⑷LV-RNAi-ANX2慢病毒感染THP-1细胞的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为100,病毒感染THP-1细胞72 h后,ANX2的表达被沉默。⑸Anti-β2GPI／β2GPI复合物刺激ANX2沉默的THP-1细胞,IRAK1、IRAK3和IRAK4的表达及IRAK1的磷酸化明显减弱(与未经病毒处理组比较p<0.05)。⑹紫杉醇(1μmol／L)能够抑制anti-β2GPI／β2GPI复合物刺激THP-1细胞IRAK1、IRAK3和IRAK4表达及IRAK1的磷酸化(与未经紫杉醇处理组比较p<0.05)。
　　 结论：①单核细胞株THP-1经anti-β2GPI／β2GPI复合物刺激后,细胞内信号分子IRAK1及IRAK4被诱导表达并致IRAK1磷酸化,最终促进细胞表达TF,可能是APS血栓形成的重要分子机制之一。②在上述过程中,IRAK3也被诱导表达,主要发挥对IRAK1及IRAK4的自身负反馈调节作用。③IRAK1／4抑制物能够降低anti-β2GPI／β2GPI诱导的THP-1细胞内IRAK1的磷酸化水平,同时抑制细胞TF的表达。这为APS血栓形成的预防及治疗提供新思路。④在anti-β2GPI／β2GPI诱导THP-1细胞表达TF所涉及的信号转导通路中,IRAKs作为关键分子而发挥作用,且与细胞表面受体ANX2及TLR4／MD-2紧密关联。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1.IRAKs的概况

1.1.1 IRAKs的基因特点和分布

1.1.2 IRAKs的功能

1.1.3 IRAKs介导的信号转导

1.2.IRAKs与自身免疫性疾病

1.2.1 IRAKs与抗磷脂抗体综合征

1.2.2 IRAKs与风湿性关节炎

1.2.3 IRAKs与其它自身免疫性疾病

1.3.结语

第二章 研究目的、方法、实验设计方案及意义

2.1 研究目的

2.2 研究方法

2.3 实验设计方案

2.4 研究意义

第三章 IRAKs在anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞表达TF中的作用

3.1 材料

3.1.1 主要试剂

3.1.2 其它试剂

3.1.3 主要溶液

3.1.4 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 单核细胞株THP-1细胞的培养

3.2.2 细胞总RNA的提取和逆转录

3.2.3 RT-qPCR分析

3.2.4 细胞总蛋白的提取及Western蛋白印迹

3.2.5 TF活性检测

3.2.6 统计学分析

3.3 结果

3.3.1 Anti-β2GPI/β2GPI诱导THP-1细胞表达TF mRNA及活性

3.3.2 Anti-β2GPI/β2GPI诱导THP-1细胞表达IRAKs及IRAK1磷酸化的时效性

3.3.3 Anti-β2GPI/β2GPI诱导THP-1细胞表达IRAKs及IRAK1磷酸化的特异性

3.3.4 不同浓度IRAK1/4抑制物对anti-β2GPI/β2GPI诱导IRAK1磷酸化的影响

3.3.5 IRAK1/4抑制物对不同刺激物诱导THP-1细胞IRAKs表达及IRAK1磷酸化的影响

3.3.6 IRAK1/4抑制物对不同刺激物诱导THP-1细胞TF表达的影响

3.4 讨论

第四章 IRAKs与细胞表面ANX2及TLR4/MD-2关系研究

4.1 材料

4.2 方法

4.2.1 单核细胞株THP-1细胞的培养

4.2.2 病毒感染

4.2.3 干扰效率内源验证

4.2.5 统计学分析

4.3 结果

4.3.1 细胞感染病毒后荧光的观察

4.3.2 ANX2干扰效率验证

4.3.3 ANX2 RNAi对anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导TlIP-1细胞IRAKs表达及IRAK1磷酸化的影响

4.3.4 紫杉醇对anti-β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞IRAKs表达及IRAK1磷酸化的影响

4.4 讨论

第五章 主要结论及展望

5.1 主要结论

5.2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章与参加的学术会议

一、攻读硕士学位期间发表的文章

二、攻读硕士学位期间参加的学术会议