逆转录环介导等温扩增快速检测禽流感病毒方法研究

摘要

为了能快速、准确地检测H5与H9亚型禽流感病毒,本研究利用逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)和LAMP实时浊度系统对两种禽流感病毒进行检测分析,建立了H5与H9亚型禽流感病毒的快速定性及定量检测方法,同时对RT-LAMP法和常规RT-PCR法进行了比较研究。
　　 本论文的研究内容及结果如下:
　　 1.对H5与H9亚型禽流感病毒HA基因进行了克隆与测序。针对H5与H9亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因保守区段内,分别设计2对特异性引物,经RT-PCR扩增后回收扩增产物,将目的片段连接至pGEM-T载体上,转化到大肠杆菌的感受态细胞,进行蓝白斑筛选,构建重组质粒pGEM-T-H5和pGEM-T-H9。通过对重组质粒进行限制性内切酶酶切、PCR扩增以及测序分析,证实试验所用毒株确实为H5与H9亚型禽流感病毒。
　　 2.建立了H5与H9亚型禽流感病毒RT-LAMP的定性检测方法。分别针对H5与H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区序列中的8个区段设计合成6条特异性引物,在恒温水浴条件下进行核酸扩增反应,对反应时间、反应温度,甜菜碱浓度、MgSO4溶液浓度进行优化,获得最佳反应条件,扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳分析和目视检查绿色荧光两种方法进行判定。所得结果与RT-PCR方法的特异性和灵敏度进行比较。整个扩增检测过程在60min内即可完成,H5与H9亚型禽流感病毒RNA的最低检测量分别为10fg和100fg,检测灵敏度分别比常规RT-PCR高1000倍和100倍,且与其它亚型禽流感病毒,新城疫病毒(NDV)无交叉反应。此方法快速、简便、灵敏度高、特异性强,是H5与H9亚型禽流感病毒的一种高效检测方法。
　　 3.建立了实时浊度检测系统对H5与H9亚型禽流感病毒的实时定量分析方法。在RT-LAMP检测方法的基础上,通过实时浊度检测系统,建立了H5与H9亚型禽流感病毒的定量检测方法。LAMP实时浊度系统通过对扩增产物的浊度进行实时定量分析,实现了对两种禽流感病毒的快速、实时、自动化检测。通过重复性试验对该系统进行验证,证明其结果稳定可靠,整个检测过程在1h内即可完成。H5与H9原始质粒DNA模板的拷贝数分别在2×108～2×104和2×109～2×105范围内与浊度达到阳性检出值0.1时的时间呈现出良好的线性关系,从而可以通过绘制出的标准曲线与浊度达到阳性值的时间求得病毒核酸的含量,该方法快速准确,简单易行,适用于基层研究及现场快速检测,为禽流感疾病的防控提供了一种新的有效途径。