骨髓瘤细胞对骨髓间充质干细胞成骨-破骨脱耦合因子影响的实验研究和小量同质骨髓标本流式细胞术检测在多发性骨髓瘤诊疗过程中作用

摘要

目的:
　　 第一部分:
　　 研究正常骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs)与骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226体外相互作用过程中,对BMMSCs的成骨—破骨耦合因子EphB4/ephrinB2、胰岛素样生长因子(IGF)-1、骨保护素(OPG)、白介素(IL)-7等的影响,从而进一步探讨BMMSCs成骨—破骨脱耦合活动在骨髓瘤骨病中的作用。
　　 第二部分:
　　 探讨小量骨髓标本流式细胞术(FCM)浆细胞检测在多发性骨髓瘤(MM)诊疗过程中的应用价值。
　　 方法:
　　 第一部分:
　　 1,采集与分离骨髓单个核细胞,体外单独传代培养至第3代BMMSCs(对照组);单独培养骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226;倒置显微镜下观察各细胞形态及生长状况;
　　 2,应用Transwell培养体系,将第3代BMMSCs与骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226分别进行共培养7天、12天(实验组),倒置显微镜下观察BMMSCs形态及生长状况;
　　 3,分别在单独培养的第3代BMMSCs及与U266、RPMI8226共培养后的BMMSCs中加入成骨条件培养液,诱导BMMSCs向成骨细胞分化,于诱导第21天,取BMMSCs分别进行碱性磷酸酶(ALP)和茜素红(AlizarinRed)染色以检测。BMMSCs的成骨能力;
　　 4,应用实时定量RT-PCR方法检测对照组及各实验组BMMSCs的EphB4/EphrinB2、IGF-1、OPG、IL-7的mRNA表达水平,并进行统计学分析;
　　 5,应用细胞免疫化学方法检测7天对照组及实验组BMMSCs的EphB4/EphrinB2蛋白表达水平。
　　 第二部分:
　　 76例次MM患者在诊疗过程中,每次骨髓穿剌抽取骨髓1ml,同一份标本分作用抗原组合CD45CD138CD38CD56行FCM,并用同质标本作常规细胞形态学检查,同时监测患者的血/尿M蛋白水平,并对上述三个指标进行比较。
　　 结果:
　　 第一部分:
　　 1,BMMSCs与U266、RPMI8226共培养后形态和生长特性未见明显改变,经成骨诱导21天后,ALP和茜素红染色后显示:实验组和对照组的BMMSCs均可在成骨诱导培养过程中向成骨细胞分化,但与骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226共培养后的BMMSCs成骨分化潜能降低。
　　 2,Real-timeRT-PCR结果显示,骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226对BMMSCs表达EphB4/EphrinB2、IGF-1、OPG、IL-7的mRNA水平有影响:7天时间点上:与U266、RPMI8226的两个共培养组同对照组相比,EphB4/ephrinB2均表达下降,除EphB4在RPMI8226共培养组与对照组之间无统计学差异,其余均有统计学差异(P＜0.05);IGF-1、OPG、IL-7表达有下降趋势,但无统计学意义(P＞0.05);12天时间点上:EphB4/EphrinB2在两个共培养组与对照组的比较下,虽有下调趋势,但均无统计学差异;而IGF-1、OPG三组之间变化不明显,IL-7虽在U266共培养组有上调趋势,但亦无统计学意义(P＞0.05)。
　　 3,细胞免疫化学结果显示:与骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226共培养后的BMMSCsEphB4、ephrinB2表达水平下降。
　　 第二部分:
　　 流式细胞术检测的骨髓瘤细胞比例与骨髓细胞形态学的检测结果相关(r=0.874,P＜0.05)。FCM在评价治疗效果时,比M蛋白可以更早地预测肿瘤负荷的下降,而对于不分泌型骨髓瘤其上述优点更为突出。
　　 结论:
　　 第一部分:
　　 1,与骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226共培养后的BMMSCs细胞形态和生长特性与正常人相比无明显差异,但其向成骨细胞分化的能力下降。
　　 2,骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226在与正常BMMSCs共培养后,诱导BMMSCs表达脱耦合因子EphB4/ephrinB2下调,可能通过BMMSCs的成骨-破骨活动的脱耦合,参与骨髓瘤骨病的发生;BMMSCs分泌脱耦合因子OPG、IGF-1、IL-7,但共培养前后无明显改变。
　　 第二部分:
　　 用小量同质骨髓标本行FCM检测,可以在MM诊疗过程中更好地评估治疗效果和预测治疗反应。