人食管癌及癌旁间质干样细胞分离培养及生物学特性研究

摘要

目的：探讨人食管癌间质干样细胞(mesenchymal stem-like cells from human esophageal carcinoma,hEC-MSCs)及癌旁间质干样细胞(mesenchymal stem-like cells from human esophageal carcinoma adjacent non-cancerous tissues,hECN-MSCs)体外分离培养方法,鉴定其生物学特性,并对两者进行比较。
　　 方法：采用胶原酶消化法从25例人食管癌及癌旁组织中分离培养hEC-MSCs及hECN-MSCs,在含有15%FBS的低糖DMEM培养基中培养、增殖并传代;流式细胞仪检测表面标记和细胞周期,绘制生长曲线,检测染色体核型,进行形态学、细胞化学与分子遗传学分析;提取细胞总RNA,逆转录成cDNA,检测细胞相关基因的表达情况;成骨诱导和成脂诱导检测其多向分化潜能;免疫组织化学技术从蛋白水平比较hEC-MSCs和hECN-MSCs中a-SMA、CK18、Nanog及VEGF表达差异;细胞增殖实验、划痕实验和平板克隆实验比较hEC-MSCs和hECN-MSCs的条件培养液(conditioned medium,CM)对食管癌细胞系EC-1.17的生长、增殖及迁移能力的影响。
　　 结果：胶原酶消化法分离的25例人食管癌及癌旁组织中,共分离培养出5例配对的hEC-MSCs和hECN-MSCs,所有实验均采用配对细胞进行研究和比较。在形态上两者均呈长梭形,NAP、POX染色均为阴性,PAS染色hECN-MSCs为阳性,而hEC-MSC为弱阳性;生长曲线、细胞周期检测显示hEC-MSCs增殖速率明显高于hECN-MSCs;两者均表达干细胞相关基因Oct-4、Nanog、BMI-1及Nucleostemin及间质细胞相关基因Vimentin、N.cadherin、TGF-β、Twist、a-SMA、Snail、VEGF和IGF-1,不表达上皮细胞相关基因E-cadherin;相比较hECN-MSCs,hEC-MSCs高表达VEGF、BMI-1、Nanog和Oct-4;流式细胞术结果表明两者均表达间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)相关表面标记CD13、CD29、CD44及CD105,不表达造血或内皮细胞的相关标记CD45、CD133、CD34及HLA-DR;相比较hECN-MSCs,hEC-MSCs中CD105表达更强;免疫组织化学分析显示,和hECN-MSCs相比,CK18和VEGF在hEC-MSCs中表达更强,对于a-SMA,两者表达强度相似,而Nanog在hEC-MSCs中呈弱表达,在hECN-MSCs中不表达。hEC-MSCs和hEN-MSCs均含有46条染色体,核型正常,均具有分化为成骨细胞及脂肪细胞的潜能。细胞增殖实验、划痕实验和平板克隆实验表明,相对hECN-MSCs的CM(conditioned medium of hECN-MSCs,hECN-MSCs-CM)而言,hEC-MSCs的CM(conditioned medium of hEC-MSCs,hEC-MSCs-CM)具有更强地促进食管癌细胞系EC-1.17生长、增殖及迁移的能力。
　　 结论：采用胶原酶消化法能有效分离hEC-MSCs和hECN-MSCs,两种细胞的生物学特性存在一定的差异;在细胞生长速率、细胞周期及CM对EC-1.17细胞影响等方面差异较为明显,其原因可能与构成肿瘤基质的hEC-MSCs能够分泌某些细胞因子有关,这些细胞因子也许与食管癌的发生、发展及转移有重要关系。