可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析

摘要

家蚕是经济昆虫，它除了抽丝结茧，制造丝绸外，目前用家蚕作为食品及副产物的综合利用越来越多。家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus，BmNPV)是家蚕的主要病原体，每年，对我国的桑蚕业造成了巨大损失。然而，经过改造的重组杆状病毒作为生物杀虫剂却能够减少农作物、食品中农药的残留及保护环境，因而已经逐渐取代传统的化学农药，广泛应用于农林防护。
　　 目前，越来越多的杆状病毒基因相继被研究报道。BmNPV基因组中还有部分基因功能未知，对这些未知功能的基因进行研究，有助于我们更加深入、全面地了解病毒自身增殖和侵染宿主的机制。基于这些理论，从分子水平上改造、修饰或替换掉某些基因，构建重组型的杆状病毒，从而更好地利用杆状病毒表达系统，或作为生物杀虫剂防治农林害虫。
　　 本研究选取了家蚕核型多角体病毒的早期基因(Bm65)和晚期基因(Bm91)为研究对象，分别从转录水平、表达水平、亚细胞定位、病毒结构定位等方面来探讨这些基因的基本特性。通过同源重组构建了相应的基因缺失型病毒，进一步对基因功能进行了研究。研究的结果主要如下:
　　 一.Bm65基因功能
　　 1.生物信息学分析发现Bm65在鳞翅目核型多角体病毒基因组中高度保守。序列分析发现一个典型的早期转录基序TATA位于起始密码子上游，预示Bm65可能为早期基因。Bm65编码一个含有104个氨基酸残基，理论分子量为12.2kDa的蛋白。InterProScan软件分析结果显示，Bm65蛋白属于一个功能未知的GIY-YIG核酸内切酶超家族，推测该基因可能与病毒DNA复制有关。
　　 2.利用大肠杆菌表达系统表达Bm65蛋白，制备了抗血清。此外，利用AcMNPV在sf9细胞中真核表达Bm65蛋白，为下一步该蛋白的纯化及体外内切酶活性的鉴定提供基础。
　　 3.转录时相分析显示Bm65的转录从病毒感染宿主细胞6h后开始到感染后72h。5'RACE分析显示Bm65只有一个位于ATG上游14个核苷酸处的转录起始位点。荧光共聚焦显微镜观察发现Bm65既位于感染后宿主的细胞质又位于细胞核。
　　 4.利用Red重组系统，用Cm基因成功地取代了Bm65后，通过抗性筛选得到缺失型病毒，并通过转座的方式获得带有polh和gfp的野生型、Bm65缺失型、补回型病毒。利用重组型病毒转染细胞后，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况，结果显示Bm65缺失后不能产生有感染性的病毒粒子。荧光定量PCR结果进一步证明Bm65缺失后不影响病毒DNA的复制。以上结果表明Bm65为病毒增殖的必需基因，但对于病毒DNA的复制而言是非必需的。
　　 二.Bm91基因功能
　　 1.Bm91被预测是一个包含105个氨基酸残基、理论分子量为11.8kDa的蛋白，在鳞翅目核型多角体病毒中高度保守。一个典型的晚期转录基序TAAG位于起始密码子上游13个核苷酸处，预示Bm91可能为晚期基因。软件分析结果显示，Bm91属于一个功能未知的杆状病毒11kDa蛋白家族，推测该基因可能与病毒粒子的形成有关。
　　 2.原核表达Bm91蛋白，制备多克隆抗体。转录分析表明，Bm91在病毒感染宿主细胞12h后开始转录，一直持续到感染后96h，且只有一个位于起始密码子ATG上游12个核苷酸处的转录起始位点。从病毒感染BmN细胞后24h开始到96h都能在病毒感染的细胞中检测到Bm91的表达。亚细胞定位显示Bm91定位于病毒感染后的BmN细胞的细胞质和细胞核。免疫印迹实验结果表明Bm91是ODV囊膜上的特异性蛋白。N-糖基化抑制实验显示Bm91未经过N-糖基化修饰。
　　 3.成功构建了Bm91缺失型病毒，通过转座得到带有polh和gfp的Bm91缺失型、补回型重组病毒。进一步的转染和感染实验发现，Bm91缺失后不影响有感染性的病毒粒子的产生，且该基因缺失后产生的BV较野生型病毒相比，滴度没有明显的变化。幼虫生物学测试实验显示缺失该基因不影响重组病毒感染宿主幼虫的半数致死剂量LDso，却使得宿主幼虫的半数致死时间LTso延长了24h，提示Bm91为病毒增殖的非必需基因，但该基因可能与病毒毒力有关。
　　 以上结果在分子水平上补充和丰富了BmNPV基因功能的研究情况，为全面了解病毒的感染和增殖机制打下基础，也为该病毒的改造和利用提供理论依据。

目录

声明

摘要

图表清单

缩略词

1 文献综述

1．1 家蚕、杆状病毒与食品

1．1．1 家蚕与食品的关系

1．1．2 杀虫剂与食品安全

1．1．3 杆状病毒杀虫剂与食品安全

1．1．4 重组杆状病毒杀虫剂

1．2 杆状病毒概况

1．2．1 杆状病毒分类及生活周期

1．2．2 杆状病毒与宿主的相互作用

1．2．3 杆状病毒宿主范围

1．2．4 杆状病毒的应用

1．3 家蚕核型多角体病毒

1．3．1 家蚕核型多角体病毒简介

1．3．2 家蚕核型多角体病毒的多样性

1．3．3 AcMNPV与BmNPV的基因组比较

1．3．4 BmNPV基因的研究进展

1．4 本研究的目的和意义

1．4．1 主要研究内容

1．4．2 研究的技术路线

2 Bm65基因生物信息学分析

2．1 分析软件及方法

2．2 结果

2．2．1 Bm65的核苷酸及氨基酸的序列特征

2．3 讨论

2．4 小结

3 Bm65的原核表达、真核表达及多克隆抗体制备

3．1 材料

3．1．1 菌种、载体、实验动物

3．1．2 酶和化学试剂

3．1．3 培养基

3．1．4 缓冲液

3．2 实验方法

3．2．1 引物设计及PCR

3．2．2 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞

3．2．3 目的蛋白的诱导表达

3．2．4 目的蛋白的割胶纯化

3．2．5 抗血清的制备

3．2．6 SDS-PAGE及免疫印迹分析

3．2．7 pAcBm65-egfp的构建

3．2．8 细胞转染

3．2．9 转染上清感染sf9细胞

3．3 结果与分析

3．3．1 Bm65克隆

3．3．2 Bm65基因的原核表达及检测

3．3．3 融合蛋白的鉴定

3．3．4 Bm65蛋白多克隆抗体的制备及检测

3．3．5 Bm65真核表达基因的克隆

3．3．6 HTB-ie1-egfp-Bm65z-SV40的构建及鉴定

3．3．7 pAcBm65-egfp bacmid的构建及鉴定

3．3．8 pAcBm65-egfp转染sf9细胞

3．3．9 免疫印迹检测Bm65的表达情况

3．4 讨论

3．5 小结

4 Bm65在BmN细胞中的转录分析和蛋白定位

4．1 材料

4．1．1 病毒、细胞和试剂

4．1．2 引物

4．2 实验方法

4．2．1 总RNA的提取

4．2．2 RT-PCR

4．2．3 5'-RACE分析

4．2．4 免疫荧光观察

4．3 结果

4．3．1 Bm65的转录分析

4．3．2 Bm65的表达时相

4．3．3 Bm65的亚细胞定位

4．4 讨论

4．5 小结

5 Bm65缺失型病毒的构建及功能分析

5．1 材料

5．1．1 质粒、菌株、试剂

5．1．2 引物

5．1．3 抗生素配制

5．2 方法

5．2．1 Bm65基因打靶线性化片段的制备

5．2．2 电转化感受态DH10Bac细胞制备

5．2．3 电击转化同源重组

5．2．4 含有pBmBm65KO的菌株中pBAD-gbaA质粒的去除

5．2．5 供体质粒pFB1-polh-gfp-Bm65的构建

5．2．6 pBmWT-GP、pBmBm65KO-GP和pBmBm65Rep-GP的构建

5．2．7 细胞转染

5．2．8 转染上清感染BmN细胞

5．2．9 病毒滴度测定

5．2．10 qPCR分析Bm65缺失后对病毒DNA复制的影响

5．3 结果

5．3．1 Bm65基因打靶线性化片断的鉴定

5．3．2 重组质粒pUC18-Bm65US-Cm-Bm65DS的酶切鉴定

5．3．3 Bm65缺失型病毒的构建及鉴定

5．3．4 pFB1-polh-gfp-Bm65的构建及鉴定

5．3．5 pBmWT-GP、pBmBm65KO-GP和pBmBm65Rep-GP的构建及鉴定

5．3．6 pBmWT-GP、pBmBm65KO-GP和pBmBm65Rep-GP在BmN细胞上的复制分析

5．3．7 病毒DNA复制分析

5．4 讨论

5．5 小结

6 Bm91基因生物信息学分析

6．1 分析软件及方法

6．2 结果

6．2．1 Bm91的核苷酸和其编码的氨基酸的序列特征

6．3 讨论

6．4 小结

7 Bm91的多克隆抗体制备、转录分析及蛋白定位

7．1 材料

7．2 方法

7．2．1 BV的纯化

7．2．2 多角体的纯化

7．2．3 ODV的纯化

7．2．4 BV/ODV囊膜蛋白的分离纯化

7．2．5 BV/ODV核衣壳的分离纯化

7．2．6 N-糖基化抑制实验

7．3 结果

7．3．1 Bm91的克隆

7．3．2 Bm91基因的原核表达及检测

7．3．3 融合蛋白的鉴定

7．3．4 Bm91蛋白的多克隆抗体制备及抗体的检测

7．3．5 Bm91的转录分析

7．3．6 Bm91的表达时相

7．3．7 Bm91的亚细胞定位

7．3．8 Bm91蛋白在病毒结构中的定位

7．3．9 N-糖基化抑制实验

7．4 讨论

7．5 小结

8 Bm91缺失型病毒的构建及功能分析

8．1 材料

8．2 方法

8．2．1 重组质粒pUC18-Bm91US-Cm-Bm91DS的构建

8．2．2 重组病毒半数致死剂量(50％ lethal dose，LD50)的测定

8．2．3 重组病毒半数致死时间(50％ lethal time，LT50)的测定

8．3 结果

8．3．1 Bm91基因打靶线性化片段的PCR扩增

8．3．2 重组质粒pUC18-Bm91US-Cm-Bm91DS的酶切鉴定

8．3．3 Bm91缺失型病毒的构建及鉴定

8．3．4 pFB1-polh-gfp-Bm91的构建及鉴定

8．3．5 pBmWT-GP、pBmBm91KO-GP和pBmBm91Rep-GP的构建及鉴定

8．3．6 pBmWT-GP、pBmBm91KO-GP和pBmBm91Rep-GP在BmN细胞上的复制

8．3．7 Bm91缺失病毒的生物学分析

8．4 讨论

8．5 小结

9 总结和展望

9．1 总结

9．2 展望

9．2．1 Bm65进一步分析

9．2．2 Bm91进一步分析

本研究创新点

参考文献

致谢

博士期间发表的研究论文和参加的课题